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艾滋病脾肾亏虚证血液代谢特征

所属栏目:临床医学论文 发布日期:2020-12-25 09:38 热度:

   代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白组学后新发展起来的全新的组学技术,其把人体当做一个完整的系统,以高通量检测终端代谢产物技术,并通过多维复杂数据进行降维和信息挖掘,分析人体在不同生理和病理阶段的代谢特征[1]。代谢组学这种“整体观念”被认为与中医理论不谋而合[2],因此,代谢组学已广泛应用于中医复方药物研究,疗效评价和中医证候研究[3-5]。艾滋病(acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的以免疫缺陷为特征的传染性疾病,目前尚无有效的疫苗预防,也无有效的药物可以将其完全治愈。虽然AIDS在中医领域是新发疾病,但治疗已取得一定效果[6-7],准确的辨证分型是中医治疗疾病的关键,AIDS的中医治疗也不例外。代谢组学技术的发展,为研究中医证候提供了新的思路。本研究拟选择AIDS常见中医证候脾肾亏虚的患者为研究对象,健康人作为对照,以超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(ultra-performanceliquidchromatographycoupledtoquadrupoletimeofflightmassspectrometry,UPLC-QTOF/MS)技术测定其血清代谢物,使用多元分析方法分析艾滋病脾肾亏虚证代谢特征,为AIDS辨证分型提供参考。

艾滋病脾肾亏虚证血液代谢特征

  资料与方法

  1.研究对象2017年6月于河南AIDS高发区共纳入37例研究对象。AIDS脾肾亏虚(AIDSPQ)组19例,其中男性10例,女性9例,平均年龄(48.32±5.85)岁;健康(JK)组18名,其中男性9名,女性9名,年龄(44.44±4.73)岁。两组性别、年龄分布差异无统计学意义,具有可比性。2.诊断标准艾滋病诊断标准:依据2015年国家卫生和计划生育委员会推荐的《艾滋病诊疗指南》[8]的诊断标准。脾肾亏虚证诊断标准按照2016年国家卫生和计划生育委员会和国家中医药管理局颁布的《艾滋病中医(成人)诊疗方案》:主症:面色少华,神疲乏力;次症:纳呆、便溏、或形寒肢冷,或腰酸、腰痛,或耳鸣,舌质淡,苔白或滑,脉沉细或弱。健康人诊断标准:HIV抗体阴性,无明显症状,身体健康无脏器严重疾病或慢性病急性发作者。3.纳入标准AIDSPS组:符合艾滋病诊断标准,符合脾气虚证诊断标准(两名副高及以上职称中医专家诊断一致),年龄18~60岁,签署知情同意书。JK组:符合健康人诊断标准,年龄18~60岁,签署知情同意书。4.排除标准不符合以上诊断标准和纳入标准者,神志不清、痴呆、各种精神病患者,非感染艾滋病所患的脏器严重疾病者,原发性免疫缺陷者,激素化疗等引起的继发性免疫缺陷者,血液病者,其它原因引起的中枢神经系统疾病者,未签署知情同意书者。5.试剂乙腈(色谱纯级,购自MerckDarmstadt,Germany公司);甲酸(HPLC/SPECTRO级,购自MerckDarmstadt,Germany公司);甲醇(色谱纯级,购自MerckDarmstadt,Germany公司)。6.仪器液质联用仪:美国WatersACQUITYTMI-ClassUPLC系统,XevoG2-XSQ/TOF质谱仪,配有Lock-spray接口,电子雾离子源(ESI),Masslynx4.1质谱工作站;高速冷冻离心机:上海力申科学仪器有限公司;真空离心浓缩仪:英国GeneVac公司;电子天平:十万分之一电子天平(梅特勒-托利多集团);低温冰箱:RevcoValueULT386-3-V42,ThermoScientific;超纯水器:上海摩勒科学仪器有限公司。7.血样采集与处理使用肝素钠抗凝管收集符合纳入标准的研究对象的清晨空腹时静脉血5mL,13000r/min离心10min,取上清液于-80℃冷冻保存备用。检测前,在室温下解冻,解冻后取200µL,加甲醇600µL,涡旋振荡30s,于4℃13000r/min高速离心10min,精密移取上清液440µL,采用真空离心浓缩仪浓缩至干;残渣用200µL甲醇溶解,涡旋振荡60s,于15000r/min高速离心10min,取上清液进样检测。8.液相色谱-质谱条件液相色谱条件:色谱柱为AcquityUPLCHSST3C18(2.1mm×100mm,1.8µm);流动相:A为乙腈,B为0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱程序:0~9min,5%A;9~19min,40%A;19~25min,100%A;25~32min,5%A;流速:0.3mL/min;进样盘温度:4℃;柱温:4℃;进样量:3µL。质谱条件:毛细管电压:3kV,质荷比范围:50~1200,采用负离子扫描模式。离子源温度110℃,脱溶剂气温度450℃,锥孔电压40V,离子能量0.8V;锥孔气流量为50L/h,脱溶剂气流量800L/h。9.数据分析检测得到的得到所有样品的总离子流图,使用Water公司自带的WatersProgenesisQI2.0sofware(NonlinearDynamics,Newcastle,U.K.)进行数据预处理,包括奇异点剔除、去噪、基线校准、重叠峰分析、峰对齐、峰识别、峰特征提取、标准化、归一化等。所得质谱矩阵数据导出到EZinfo3.0或SIMCA-P13.0(Umetrics,umeå,Sweden)进行PCA和OPLS-DA等多元分析。通过构建基于OPLS-DA模型,根据变量的重要变量因子(variableimportanceintheprojection,VIP)值挑选差异物,并对挑选出的变量进行独立样本t检验进行验证。差异物VIP>2,P<0.05和变化倍数>3或者<0.33确定为组间的差异代谢物。使用Water公司自带的WatersProgenesisQI2.0software推测可能代谢物的物质。

  结果

  1.PCA结果UPLC-QTOF/MS技术对血清检测结果进行预处理后,首先采用PCA方法对AIDSPS组和JK组血清样本进行多元分析,共得到有2个主成分的模型(R2=0.337,Q2=0.221),得到的散点图(图1)显示两组可以得到区分,有明显的差异性。2.OPLS-DA结果本研究的OPLS-DA模型,R2Y=0.972,Q2=0.950,表明模型有较好的解释性和预测性。模型的方差分析结果显示F=152.06,P<0.05,模型有效。OPLS-DA模型的得分图见图2A,结果显示,此模型可以把AIDSPS组与JK组明显区分。OPLS-DA模型置换检验(n=200)中左端任何一次随机排列产生的R2、Q2值均小于右端的原始值,Q2截距值等于或小于0,则表明模型有效[9]。R2、Q2值均小于右端的原始值,Q2截距值<0,则表明模型有效,没有过度拟合,见图2B。3.差异代谢物筛选结果在OPLS-DA模型中VIP>2,变化倍数>3.00或者<0.33,并通过t检验,P<0.05的变量确定为组间差异代谢物,共确定差异代谢物共11种,AIDSPQ组与JK组比较降低的是:磷脂酰肌醇、前原卟啉Ⅸ;升高的是:番茄素、牛磺胆酸、甘氨酸、甘氨胆汁酸、牛磺去氧胆酸、偏酸、葡萄糖苷酸、鹅去氧胆酸甘氨酸偶联物、胆红素,结果详见表1。

  讨论

  中医证候乃是疾病发生发展过程中生理病理的总结,是中医了解疾病的关键所在。证候理论是中医临床治疗疾病的总纲,证候分类方法则是中医诊治疾病进行辨证的根基。然而,中医证候理论和证候分类的物质基础近年来并未取得明显进展[10],究其根本可能是仍然缺乏适宜的方法和途径,获得行业认可的科学数据支撑中医证候理论,从而使中医证候理论保持良好的持续发展。代谢组学的发展为中医证型研究提供了新的方法,代谢组学已经越来越多的运用于中医证型研究领域并取得了一定的成果[11-12]。代谢组学技术在AIDS中医证候领域也有应用[13-14]。许前磊等[15-16]运用氢核磁共振技术检测出AIDS肺脾气虚证患者与健康人尿液代谢差异代谢物为α-氨基丁酸、甲基丁二酸等物质;用液质联用技术检测出AIDS湿热内蕴证患者与健康人血液代谢差异代谢物为酰基甘氨酸、溶血磷脂酰胆碱。马素娜等[17]运用液相色谱质谱分析技术检测出艾滋病肺脾气虚证组和艾滋病气阴两虚证患者尿液潜在的4种差异代谢物。王娟等[18]利用高效液相色谱质谱联用技术将AIDS肺脾气虚证患者和健康志愿者血液代谢轮廓得以明显区别,并推断出的9种可能的差异代谢物。本研究选择AIDS脾肾亏虚证患者为研究对象,健康人作为对照,以UPLC-QTOF/MS技术测定其代谢产物,可以将两组患者明显区分,并发现了11种代谢差异物,分别是磷脂酰肌醇、前原卟啉Ⅸ、番茄素、牛磺胆酸、甘氨酸、甘氨胆汁酸、牛磺去氧胆酸、偏酸、葡萄糖苷酸、鹅去氧胆酸甘氨酸偶联物、胆红素。这些物质主要涉及脂质代谢,特别是胆汁酸代谢途径;其次涉及氨基酸代谢途径,如甘氨酸和前原卟啉Ⅸ。代谢组学技术对于脾肾亏虚证的研究尚未见报道,战丽彬等[19]运用UPLC-QTOF/MS技术检测出脾气虚证患者血浆中甘油磷酸胆碱和肉碱低于健康人,施旭光等[20]使用核磁共振氢谱在脾气虚证患者和健康志愿者尿液中共筛选得到谷氨酸、甲硫氨酸、α-酮戊二酸、二甲基甘氨酸、肌酐、牛磺酸及葡萄糖7种差异代谢产物;董飞侠等[21]发现肾阳虚患者与健康人尿液对照,代谢差异物为丙氨酸、胺基丙二酸二乙酯、脯氨酸、柠檬酸、马尿酸和组胺等物质。代谢组学对相同或相近证型的研究结果都不尽相同,可能是由于证候判断、检测标本或者检测技术差异。运用代谢组学技术探索中医证候的分型虽然取得一定的进展,但由于代谢组学技术的灵敏性,其受到的影响因素很多,而且由于生物代谢的复杂性及中医证候的多态性,其依然存在局限性。但不可否认用代谢组学技术研究中医证候有广阔的发展前景和潜力。

  《艾滋病脾肾亏虚证血液代谢特征》来源:《中华中医药杂志》,作者:金艳涛 杨春玲 袁君 马秀霞 武悦 许前磊 刘志斌

文章标题:艾滋病脾肾亏虚证血液代谢特征

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