摘要：肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)感染严重危害儿童生命安全。其致病机理尚未完全明确。EV71感染既可以激活模式识别受体诱导机体的固有免疫应答，病毒自身也进化出独特的机制逃避固有免疫的杀伤。此外，固有免疫应答也与EV71致病机理、临床特点密切相关。本文就以上方面的最新研究进展进行综述及讨论。
关键词：医学期刊投稿,肠道病毒71,固有免疫,信号转导,Ⅰ型干扰素,细胞因子
肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是除脊髓灰质炎病毒外最重要的嗜神经型病毒之一。主要感染学龄前儿童，临床表现轻重不一，从轻微的手足口病或疱疹性咽峡炎，到无菌性脑膜炎、脑炎、肺水肿和死亡[1]，目前尚无有效的药物和预防手段。EV71引起疾病不同临床表现的机制至今尚不清楚，推测与EV71感染导致异常的免疫反应有关。动物机体对病毒感染的免疫应答分为固有免疫应答和适应性免疫应答两个层次。其中，固有免疫应答不但是机体抵抗病毒侵染的第一道防线，而且负责启动和调节机体适应性免疫，在整个抗病毒免疫反应中发挥着十分重要的作用[2]。现就EV71感染宿主固有免疫应答的研究进展综述如下。
1 固有免疫与病毒感染
固有免疫也称天然免疫，是宿主防御病原体入侵的首道屏障。主要通过胚系编码的模式识别受体(PRRs)识别病原微生物保守的相关分子模式(PAMPs)，实现对外来病原体的早期识别，进而启动固有免疫的效应机制。病原体入侵宿主，PRRs迅速激活，通过特异的信号级联反应活化转录蛋白，从而诱导靶基因、促炎细胞因子、Ⅰ型干扰素(Ⅰ型IFN，INF-α/β)等的表达，诱导感染部位产生炎症反应，吸引并激活巨噬细胞(MC)和树状突细胞(dDCs)等免疫细胞，从而清除病原微生物;同时上调抗原递呈细胞(APC)表面共刺激分子的表达，诱导T或B淋巴细胞活化、增殖、分化为效应T或B细胞，产生病原特异性的适应性免疫应答[3]。固有免疫和适应性免疫在感染的各个阶段协同作用，最终清除入侵的病原微生物。
病毒释放的PAMPs主要是核酸类物质，包括病毒基因组DNA、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、5'三磷酸RNA和表面糖蛋白等[3]。宿主PRRs主要有四类[4]：Toll样受体家族(TLRs)、RIG-Ⅰ样解旋酶受体家族(RLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRs)的一些成员，以及ERIS(STING/MITA)等蛋白质。PRRs分布在不同类型的细胞，不同的PRRs识别不同的PAMPs，并具有细胞特异性，激活不同的信号通路[5]。
已知哺乳动物有13种TLRs，表达在DCs、MC、淋巴细胞及其他细胞。TLR3、TLR7、TLR8、TLR9主要识别病毒DNA及RNA成分，TLR2、TLR4识别病毒糖蛋白[3]。RLRs有三个成员：视磺酸诱导基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ，DDX58，DEAD)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5、IFIH1)和遗传学和生理实验室蛋白2(LGP2)，RLRs在包括免疫细胞和非免疫细胞表达，可以识别细胞内RNA病毒成分[3]。另外两类PRRs主要识别细胞内DNA[4]。
2 EV71感染的固有免疫识别
体外和动物研究的结果表明，小RNA病毒EV71与其他家族成员一样，通常由TLRs与RLRs识别其核酸[3]。Gong X等[6]经RT-PCR证实，感染EV71的人单核细胞源巨噬细胞(MDMs)，TLR2、TLR7和TLR8的表达显著增强，增强的IL-8和TLR2基因表达也在紫外线失活EV71感染的MDMs发现，分析很可能是细胞表面上的TLR2和病毒蛋白相互作用的结果，认为TLR2，TLR7和(或)TLR8参与了EV71相关分子模式的识别。虽未直接检测到TLR3表达增加，但另一研究观察到感染细胞中TLR3信号通路的关键转录因子干扰素调节因子3(IRF3)下调和干扰素刺激基因(ISG)磷酸化抑制，表明EV71和TLR3之间有关联[7]。另外，EV71 3C蛋白酶(3Cpro)与RIG-Ⅰ相互作用，随后破坏RIG-Ⅰ依赖的Ⅰ型IFN反应所需的RIG-Ⅰ-IPS-1复合体[8]，提示RIG-Ⅰ途径可能参与识别EV71。最近，Kuo RL等[9]使用EV71 RNA作为激动剂，在基因敲除实验中显示MAD5表达减少，IRF3的活化与IFN-βmRNA表达相应降低，表明MDA5参与了EV71的PAMP识别。
PRRs基因的多态性也可能是EV71感染的危险因素。有国内的学者[10]检测了87例有症状的EV71患者与57例无症状EV71感染对照组TLR3、RIG-Ⅰ以及MDA5的基因多态性，有序Logistic回归分析显示MDA5(rs1990760)的多态性与EV71感染的严重程度相关。提示通过调查EV71感染固有免疫机制，有可能识别高危婴幼儿。
3 EV71感染宿主固有免疫信号转导及应答
EV71与其他小核糖核酸病毒的RAN被免疫细胞识别后，通过招募特异接头蛋白激活一系列信号级联反应，诱导Ⅰ型IFN和促炎细胞因子的产生[3]。目前公认的大部分TLRs通过髓样分化因子88(MyD88)途径传导信号，进而活化白介素1受体相关因子激酶(IRAKs)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，最终激活IRF7和核因子-κB(NF-κB)，诱导IFN-α等细胞因子的表达。而TLR3则通过干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)途径(即MyD88 非依赖途径)，一方面通过激活TBK1(TANK-binding kinase1)或IKK(IκB kinase)激酶复合体，活化转录因子IRF3或IRF7，最终诱导Ⅰ型IFN的表达;另一方面，通过激活IKKs活化NF-κB，最终诱导一系列炎症因子的表达[4]。RIG-Ⅰ和MDA5识别双链RNA后，激活下游的接头蛋白IFN-β启动刺激因子(MAVS，IPS-1、VISA或Cardif)，MAVS招募TRAF3或TRAF6形成功能复合体，从而进一步激活激酶TBK1/IKK-i或IKKs。TBK1/IKK-i使得IRF3或IRF7发生磷酸化，诱导Ⅰ型IFN的表达;而IKKs通过激活NF-κB，诱导一系列炎症因子的表达[4]。 Ⅰ型IFN的早期感应及活动，使细胞迅速建立抗御病毒感染状态，抑制病毒复制及传播。然而，EV71诱导Ⅰ型IFN产生的研究结果并不一致。起初在小鼠模型中发现，早期使用重组IFN-αA，保护小鼠对抗EV71感染，而用抗IFN-α/β中和抗体预处理，则极大地提高了小鼠对EV71的易感性，死亡率及组织病毒载荷增加;虽然证实Ⅰ型IFNs对EV71感染的保护作用，但EV71接种没有引起小鼠血清Ⅰ型IFNs增加[11]，也不能诱导人类MDMs释放IFN-α[6]。临床上，传统的干扰素治疗对EV71感染患者疗效轻微。不过，最近一项研究证明EV71感染过程中可适度刺激INF的生产，但EV71诱导的INF或外源性INF治疗不能有效触发下游信号级联反应以抑制病毒的复制[12]。对于这些矛盾的结果，目前学者们公认与EV71进化了机制以逃避宿主免疫杀伤有关。
细胞炎症因子的分泌是构成防御病毒的第一道防线的重要部分，然而，也与EV71感染的发病机理密切关联。临床研究显示，EV71感染伴自主神经功能失调患者IL-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的血浆水平升高[13]，并发脑炎与肺水肿患者IL-1β、IL-6水平显著高于无并发症的患者[14-16]。因此，升高的IL-6可能代表了IL-1β和TNF-α生物学作用的"网络效应"。近年陆续报告EV71感染患者血液和脑脊液IL-10、IL-13、IFN-γ、IFN-γ诱导蛋白-10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、MIG(IFN-γ诱导单核因子)、IL-1受体拮抗剂和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等增高，并与与EV71疾病严重程度相关[15-17]，说明由IL-6、IL-1β和TNF-α等介导的急性期蛋白和趋化因子激活可能会加剧病毒诱导的炎症和病理学变化。Khong WX等[18]用抗IL-6抗体治疗EV71感染的新生小鼠，与对照组相比显著降低了死亡率和组织破坏程度，而且这些保护作用不依赖于病毒载荷。提示高水平IL-6可能与EV71感染过程中的发病率和死亡率存在因果关系，针对IL-6信号治疗可能是治疗重症EV 71新的研究目标。
发育研究表明，固有免疫反应具有年龄依赖性的特点，有些特定模式在生命的早期被表达，而成人型模式在童年时才逐步建立[19]。比如婴幼儿对感染信号的固有免疫应答中，产生较高水平的某些促炎细胞因子，特别是IL-6、IL-1β、IL-23，并表现出偏向Th2和Th17型辅助T细胞的反应，而抑制细胞内病原体重要的Th1型细胞因子IFN-α和IL-12p70水平则较低[20，21]。因此，最近有学者提出，由于免疫应答存在年龄依赖性，那么，控制病毒复制不力，或优先产生病理性免疫应答，或两者共同作用，可以解释EV71感染婴幼儿严重病例和死亡率较年长儿高的现象[19]。
4 EV71感染对固有免疫的调节
在DC等APC在通过PRRs启动抗感染免疫应答的同时，病毒也通过进化出的各种机制来抑制PRRs介导的信号通路，从而逃避宿主对病毒的免疫杀伤。EV71编码的的非结构蛋白3C、2A、2C都参与了此类调节。
4.1 EV71 3Cpro 几乎参与了病毒复制过程的所有蛋白剪切，并针对宿主细胞固有免疫途径的多个组件，导致I型IFN应答的抑制。3Cpro通过分解RIG-Ⅰ-IPS-1复合物和破坏IRF3核转位阻断RIG-Ⅰ信令[7];与TRIF结合，在半胱天冬酶抑制剂(Z-VAD-FMK)存在的条件下诱导其裂解，抑制其下游基因的表达[8];直接切割信号分子TRAF3[22]、IRF7 [23]、IRF9[24]。3Cpro还裂解灭活多聚腺苷酸化系统裂解刺激因子(CSTF-64)，抑制宿主前体mRNA 3'-末端加工和多聚腺苷酸化，可能会导致宿主细胞mRNA的成熟抑制[25]，有可能参与抵抗细胞抗病毒应答，包括抑制病毒诱导的IFNβ产生。
4.2 EV71 2Apro 另一个蛋白酶，新近研究证实，它以RIG-Ⅰ样受体MDA5为水解目标[26]，并通过靶向切割在RIG-Ⅰ和MDA-5激活的信号转导途径中的关键接头分子MAVS[27]，有效封锁IFN-Ⅰ转录的上游，抑制Ⅰ型IFN的产生。Lu J等[12]还发现2PRO降低了干扰素受体1(IFNAR1)水平，阻止下游信号通路，从而抑制ISGs的活化。此外，2A pro可切割核孔蛋白62(Nup62)，导致核孔复合物跨膜转运功能的障碍，因而，可导致细胞因子、IFN等抗病毒蛋白的合成受到抑制，从而无法有效的清除病毒，这可能是EV71逃避先天性免疫引起重症病例或死亡病例的重要机制之一[28]。
4.3 EV71 2C 可直接与IKKβ相互作用，抑制IKKβ的活化和IκBα(IKK)的磷酸化/降解，从而抑制TNF-α诱导的NF-κB的激活[29]。以此调节宿主的固有免疫反应。
4.4其他 不久前刘颖等[30]用EV71(VR1432)感染Vero E6细胞后，进行干扰素刺激，发现细胞核内磷酸化转录激活因子1(STAT1)表达水平与胞质内相比明显降低，表明EV71感染抑制Ⅰ型IFN信号通路中干扰素刺激基因因子3(IFN-stimulated gene factor 3，ISGF3，STAT1/STAT2/IRF9)的核转位，从而影响干IFN效应途径中抗病毒蛋白的表达。
由此可以见，EV71利用其3Cpro、2Apro、2C等，从基因转录水平到蛋白翻译水平多层次的抑制参与抗病毒固有免疫的效应分子合成，从而使得病毒能够突破固有免疫应答的防线对宿主造成进一步感染。针对这些环节的治疗策略，有可能会改变疾病的预后。如蛋白酶抑制剂Rupintrivir对EV71 3Cpro有很好的抑制作用，体外用Rupintriviru与IFN-α组合处理EV71感染的细胞，对细胞病变效应的抑制作用比任何一个药物单用显著，显示了强大的协同抗EV71活性[24]，为EV71感染治疗展示了广阔的前景。 综上所述，EV71感染后固有免疫应答在抗病毒感染中起到了不可替代的重要作用，EV71也进化了机制逃避固有免疫的杀伤。但EV71与宿主固有免疫之间相互作用、以及固有免疫与适应性免疫协同完成对EV71的免疫清除的机制，目前尚未完全明确。探索这些机制，有助于阐明EV71致病和组织损伤机理，为疫苗研发以及制定治疗疾病的新策略提供理论依据。
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