【摘要】 目的：研究壳聚糖-磷酸三钙复合材料(CTCP)支架的制备新方法及其制品性能。方法：采用重结晶-冻干法制备支架，通过大体观察、pH值、孔隙率及孔隙直径测定、细胞复合培养来研究支架性能，直接冻干法支架作为对照。结果：重结晶法最优组较对照组在孔隙率上比较差异有统计学意义(P<0.05)。孔隙直径也更理想，以100～300 μm为主;细胞能进入材料的孔隙并生长良好。结论：重结晶法制备聚糖-磷酸三钙支架有更好的孔隙质量;较高的重结晶温度和速率可能是提高孔隙质量的有利因素。
【关键词】 医学论文,壳聚糖,磷酸三钙,支架,组织工程,重结晶法
Study of Recrystallization Method Using in Chitosan/Tricalcium Phosphate Scaffold Freeze Drying and Performance Assessment of the Products/MO Bi-fan，MO Bi-wen.//Chinese and Foreign Medical Research，2014，12(20)：3-5
【Abstract】 Objective： To explore the new method of chitosan/tricalcium phosphate(CTCP) scaffold preparation， and the scaffold’s performance assessment. Method： CTCP scaffolds were prepared by recrystallization method and ordinary mode， which were investigated by macroscopic observation， pH value， porosity， pore diameter and cell co-culture.Result： The best experimental group present significantly difference between control group in porosity(P<0.05).Which had better pore diameter in 100-300 μm mainly and cell co-cultured present well-growing through the pore.Conclusion： CTCP scaffold has better pore quality， higher recrystal temperature and it’s rate could be the favorable factor to improve the quality of scaffold pore.
【Key words】 Chitosan; Tricalcium phosphate; Scaffold; Tissue engineering; Recrystallization
First-author’s address： Guilin Medical College Affiliated Hospital， Guilin 541001，China
在医疗实践中组织、器官的缺损是很常见的症状。组织工程学是近年来发展起来的一门新兴边缘学科，其基本方法是将生长因子/活细胞种植于具有良好生物相容性和降解度的生物材料支架(scaffold)上，培养后将生长因子/活细胞生物材料复合体植入机体病损部位以形成新的具有其原来功能和形态的组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的，其中生物材料支架是组织工程的基本要素[1]。通过学习冷冻物理学的相关原理，本研究在医学领域创新性地使用冷冻-重结晶的方法处理基材溶液以获得更理想的冰晶结构，然后通过冻干法制备出新型的壳聚糖-磷酸三钙复合材料(chitosan/tricalcium phosphate，CTCP)支架，并测试其组织工程相关性能，为组织工程材料进展提供有益的实验依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
壳聚糖(山东金湖甲壳制品公司，批号20110302，脱乙酰度96.7%，灰分0.55%);磷酸三钙(广东台山市众城化工公司，分析纯);乙酸(广东西陇化工公司，分析纯);DMEM/H(Hyclone，美国);胎牛血清(Gibco，美国);胰蛋白酶(Gibco，美国);FGF- 2(ProSpec，以色列);pH广泛试纸(杭州特种纸业公司);石膏振荡器(安华齿科公司，中国);120目分样筛(振兴筛具厂，中国，孔径120 μm);聚四氟乙烯培养皿(9 cm直径);真空搅拌器(保定兰格自动化公司，HB8135A，配真空泵);生物冰箱(美菱公司，中国);冷冻干燥机(CHRIST ALPHA 1-2，德国);体视显微镜(Olympus SZX-10，日本，倍数6.3～63);高速离心机(Avanti J-E，贝克曼公司，美国);倒置相显微镜系统(Olympus CKX41，日本)。
1.2 原料的处理
磷酸三钙研磨后辅以石膏振荡器过筛，得到直径小于120 μm的粉粒;乙酸与蒸馏水配制成5%溶液。将2.5 g壳聚糖粉末与2.5 g磷酸三钙粉末混匀，加入装有5%醋酸溶液95 ml的烧杯中。烧杯放进真空搅拌器，抽真空，期间调节转速达到混匀粉液、去除气泡的目的。20 min左右形成均匀的胶状混悬液。将该液分装于培养皿，厚度4 mm左右。放入-24 ℃的冰箱冷冻层内预冻成型。
1.3 重结晶处理 盖上培养皿，分3组进行重结晶，同时冷干机开始预热：Ⅰ组置于室温23 ℃ 5 min;Ⅱ组置于冰箱11 ℃ 15 min;Ⅲ组置于冰箱0 ℃ 30 min;然后移入冷干机搁板上，密封干燥箱(筒)，开启冻干程序，试样完成最后的重结晶再冻结过程。Ⅳ组不进行重结晶，直接进入冻干作为对照组。
1.4 冻干
冷干机继续运行，按程序冻干24 h，之后干燥，得到固体试样。
1.5 检测方法
1.5.1 大体观察 以手术刀片切开试样，肉眼观察试样表面及内部的孔隙分布情况。
1.5.2 pH值测定 制备72 h后的试样，用蒸馏水湿润pH广泛试纸，贴附于试样表面2 s后取下，对照色带。每个试样正面和底面做多处测试。
1.5.3 孔隙率的测定 用乙醇替代法测定材料孔隙率。每组2个试样各剪成1/4圆面积得到每组8个样品。将每个样品置于一定体积的(V1)乙醇中，用冻干机常温抽真空至15 m bar脱气泡后，材料和乙醇总体积记为V2，再将材料移出，剩余乙醇体积记为V3，则材料孔隙率p=V1-V3/V2-V3;计算各组平均孔隙率;对重结晶孔隙率最高组(Ⅰ组)与Ⅳ组的组间差异进行统计学分析。
1.5.4 孔隙直径的测定 将Ⅰ、Ⅳ组试样用体视显微镜(olympus szx10)以6.3倍率观察、测量孔隙直径。均匀选取多点。
1.5.5 细胞复合支架材料观察 将Ⅰ组成品试样剪成2 mm×
5 mm×1 mm大小，置于培养皿中，用(2～3)×10-7 m波长紫外线消毒，距离15 cm，照射0.5 h。灭菌PBC每次浸泡10 min、以滴管基本吸干，换液3次后备用。细胞的收集和接种：用0.25%胰蛋白酶消化鸡胚成纤维细胞，1000 r/min离心5 min，收集细胞，调整细胞浓度至5×106 个/ml。将细胞直接加入已经处理好的材料中，在37 ℃湿化空气孵箱中培养(DMEM，双抗，10 ng/ml FGF-2，10%胎牛血清)，隔日换液。倒置相差显微镜观察细胞生长及与生物材料粘附情况。
2 结果
2.1 大体观
-24 ℃预冻成型时，冰冻物肉眼可见极细小冰晶密布;重结晶后三组都出现更粗大的梭形冰晶，呈组状交织排列;冰晶大小和分布面积，Ⅰ组>Ⅱ组>Ⅲ 组。试样为圆饼形，黄白色，海绵状多孔隙结构，孔隙呈组状交织排列及无序排列，底面见磷酸三钙粉末沉积现象。试样具有一定强度。干燥时脆性大，吸湿后呈现一定的韧性从而能被裁剪成特定形状。肉眼看试样的孔隙大小和分布面积，Ⅰ组>Ⅱ组>Ⅲ组>Ⅳ组。
2.2 pH值
试样各处pH值均匀，均为8，呈弱碱性。
2.3 孔隙率
Ⅰ组孔隙率93.3%，Ⅱ组74.6%，Ⅲ组68.1%，Ⅳ组47.6%。Ⅰ组(最优组)、Ⅳ组(对照组)间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
2.4 孔隙直径
孔隙直径变动较大。Ⅰ组在该倍率下以100～300 μm的孔隙为主，见图1;Ⅳ组多数孔径低于100 μm。
图1 Ⅰ组支架孔隙6.3倍图
2.5 细胞复合培养
镜下观察见部分细胞生长进入材料孔隙内细胞形态大部分亦呈梭形且簇集，生长情况良好，详见图2。
图2 材料与细胞复合培养100倍图
3 讨论
近年来应用组织工程修复组织缺损成为研究热点。其中使用生物材料制备的支架是一个关键环节[2]。壳聚糖是由一种具有无毒、抑菌易降解等优秀性能的生物材料，磷酸三钙与之复合制作支架，能提高支架的强度、韧性及成骨性能[3-4]。壳聚糖多是由虾、蟹等类水生动物的甲壳提取的甲壳素脱乙酰化而得到的，溶于醋酸等有机溶剂形成凝胶，易于塑形，用冻干法脱水可制备出三维多孔性结构支架。它作为支架材料的优点有：无毒，具有优良的生物相容性和可降解性，能够促进具有成骨潜能细胞的分化并有利于骨形成，可促进多种组织细胞的黏附和增殖，是理想的生物材料[5-7]。值得一提的是壳聚糖具有抑菌性，有实验表明，以金黄色葡萄球菌诱导家兔使其发生骨髓炎，壳聚糖可降低其感染率[8]。磷酸三钙具有良好的生物相容性和骨引导活性，机械性能好，其降解产物呈碱性，而弱碱性环境利于成骨细胞帖附、增殖，从而降低壳聚糖降解产生的酸性[9]。此外磷酸三钙具有良好的可降解性，这是组织工程材料的一个重要要求[10]。某些生物相容性好的材料如羟基磷灰石(HA)，由于不能降解，并不符合组织工程支架的要求[11-13]。
具有合适的微观孔结构是骨组织工程用多孔支架能否发挥最优成骨效能的关键。微观孔径结构主要指孔径大小、孔隙率、孔间连通程度、连通孔道的扭曲程度和支架表面积。支架应具有尽可能高的孔隙率才能满足细胞和新生毛细血管的生长进入，实现营养输运和废物排泄，最终完成新生组织和器官的完成。对于孔径多少合适一直存在争议：一般认为孔径在100 μm以上才能使成骨细胞在孔洞内游移，以孔径在200 μm以上有较优的成骨效能[14]。Jones等[15]报告，以孔径大于100 μm的网孔生物活性玻璃作为组织工程支架取得满意结果。马宁等[16]制备孔径约100～400 μm的壳聚糖-聚磷酸三钙复合材料复合培养牙周膜细胞效果良好。
冻干法制备支架其孔径大小取决于预冻是形成的冰晶大小，通常可通过调整冷冻速率来控制，冰晶的生长方向可通过定向结晶控制[17]。但精密可控降温冷冻设备并不普及，且有昂贵、耗时的缺陷。重结晶是指在加热时由于小冰晶的分子向大冰晶迁移，而使固相系统中晶体大小的分布渐渐发生变化的过程。在该过程中，小于临界尺寸的冰晶变小直至消失，大于临界尺寸的冰晶逐渐长大[18]。研究证实退火过程中的相行为和重结晶还可以减小由于成核温度差异造成的冰晶尺寸差异及干燥速率的不均匀性，提高干燥效率和药品均匀性[17]。作者用实验室通用冰箱进行样品溶液的全域冷冻，然后借鉴退火原理，通过升温将预冻好的玻璃态样品重结晶，达到促成更完全结晶、改变冰晶形态和大小分布的目的，结果证实重结晶孔隙率最优组与未重结晶组存在显著差异，孔隙直径也更理想[19]。 本研究中试样pH为8，呈弱碱性，将有利于利于成骨细胞帖附、增殖。Ⅰ组试样孔隙直径以100～300 μm为主，孔洞之间互相通连形成良好的三维多孔网状结构，孔隙率93.3%，达到较理想组织支架的效果。细胞复合培养及后续的动物实验也证实了这一点。试样的孔隙大小、分布面积和孔隙率，Ⅰ组>Ⅱ组>Ⅲ组，这可能表明较高的重结晶温度和速率导致更大更多的结晶生成，这与Kramer等[20] 的研究结论是相似的。关于各类制剂的退火(重结晶)温度、持续时间、结晶大小、结晶率以及溶液浓度等的多因素数学模型很复杂，目前国内外都未见建立，这也是本研究未解决的问题，有待后续进一步研究。
参考文献
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