农业科技论文镰刀菌葡萄糖淀粉酶部分酶学性质研究

所属栏目:农业经济科学论文 发布日期:2014-04-08 10:00 热度:

  葡萄糖淀粉酶(E.C3.2.1.3)从淀粉的非还原端水解α-1,4糖苷键产生β-D-葡萄糖,由于葡萄糖淀粉酶对淀粉的水解以葡萄糖为惟一产物[1],因此葡萄糖淀粉酶在以葡萄糖为原料的一些生物行业有广泛应用,特别是在食品、医药、发酵等领域[2,3]。

  摘要:对串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)和禾谷镰刀菌(F.graminearum)所产葡萄糖淀粉酶部分酶学性质进行了研究,结果表明这2种镰刀菌产的葡萄糖淀粉酶的性质较为相似。50~60℃酶活性较高,最高酶活性出现在50℃,串珠镰刀菌比禾谷镰刀菌所产生的酶热稳定性稍高。pH5.0~6.0之间酶活性较高,pH5.0~8.0之间稳定。金属离子Mn2+、Cu2+对2种镰刀菌产酶的酶活性有较强的激活作用,其中Mn2+激活作用最强烈,Mn2+作用后禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌葡萄糖淀粉酶的活性分别为对照的176%和173%。金属离子Na+、Ca2+及Fe2+则会抑制这2种镰刀菌产葡萄糖淀粉酶的活性。

  关键词:串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme),禾谷镰刀菌(F.graminearum),葡萄糖淀粉酶,酶学性质

  工业上应用的葡萄糖淀粉酶主要来自于曲霉属(Aspergillus)及根霉属(Rhizopus)[4-10],镰刀菌属(Fusarium)的葡萄糖淀粉酶报道较少。曲霉属及根霉属菌株葡萄糖淀粉酶及其酶学性质的研究较多[6-10],镰刀菌属的葡萄糖淀粉酶,如半裸镰刀菌(F.pallidoroseum)[11]、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)[11]、茄腐皮镰刀菌(F.solani)[12]、蔗草镰刀菌(F.scirpi)[12]等也有报道,不同来源的酶性质存在很大差异。这些丝状真菌能够将合成的酶蛋白分泌到胞外,便于酶的提取纯化。不同来源的葡萄糖淀粉酶性质不同,在耐热性、pH稳定性以及催化活性上都存在差别,而不同的生物加工过程需要不同性质的酶,因此对新型的葡萄糖淀粉酶进行筛选并开展性质研究显得特别重要。

  前期对几十株真菌进行了淀粉降解酶的筛选工作,从中得到产酶活性较高的一株串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)以及一株禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum),本研究对其中的部分酶学性质进行了研究。

  1材料与方法

  1.1材料

  串珠镰刀菌以及禾谷镰刀菌由山东省应用微生物重点实验室筛选并保存。生化试剂均为国产分析纯。

  1.2方法

  1.2.1固态发酵250mL三角瓶中装麦麸5g,加水5mL,121℃蒸汽灭菌。用7mm打孔器从长满菌丝的PDA平板上打出3个菌斑接种至三角瓶,28℃静置培养。分别于72h以及96h摇动一次,120h时测定酶活性。发酵结束后固体产酶培养基中加灭菌蒸馏水100mL,捣碎,28℃摇床振荡浸提1h,4℃、6000r/min离心10min,上清液为粗酶液。

  1.2.2硫酸铵沉淀蛋白向葡萄糖淀粉酶粗酶液中加入硫酸铵,不断地缓慢搅拌,直至硫酸铵浓度达到80%饱和度,置于4℃冰箱过夜;10000r/min离心15min,弃上清,将沉淀蛋白用蒸馏水溶解,透析后用于测定粗酶的酶学性质。

  1.2.3酶活测定[13]底物为用0.1mol/LpH6.0磷酸盐缓冲液体配制的1%可溶性淀粉溶液。25mL刻度试管中加底物0.9mL,在测定温度下预热10min,加0.1mL适当稀释的粗酶液准确反应5min,加2mLDNS溶液,煮沸5min,流水冷却,稀释至25mL,540nm测定吸光值。1h释放1mg还原糖(以葡萄糖计)的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

  1.2.4最适反应温度和热稳定性[14]于不同温度下测定酶活,最高酶活定为100%,其余酶活与之相比计算相对酶活,寻找酶的最适反应温度。取适量酶液不同温度下保温,保温结束立即置于冰水中冷却,测定残余酶活,研究酶的热稳定性,以不经热处理的酶活为100%。

  1.2.5最适反应pH和pH稳定性分别用不同pH的磷酸缓冲液配制可溶性淀粉溶液,测定酶活,最高酶活定为100%,其余酶活与之相比计算相对酶活,寻找最适反应pH。取适量酶液分别在不同pH缓冲液中30℃保温6h,测定残余酶活,研究酶的pH稳定性;以未处理的酶活力为100%,计算相对酶活。

  1.2.6金属离子对酶活力的影响[14]在反应体系中分别加入(盐酸盐或硫酸盐)Cu2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Na+,使其终浓度为2mmol/L,室温下静置30min,测定酶活;以不加金属离子的空白对照酶活为100%。

  1.2.7酶解产物的薄层层析[15]在0.5mL1%可溶性淀粉中加入适当稀释的硫酸铵沉淀的酶液0.1mL,30℃反应1h,然后在硅胶板上进行薄层层析,展开液为丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2,碘缸内染色24h。

  2结果与分析

  2.1酶活性

  对2种镰刀菌进行固体培养并测定酶活性,以实验室保存的一株黑曲霉为对照,结果如图1所示。黑曲霉葡萄糖淀粉酶酶活为1206U/g,串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌分别为783U/g以及1065U/g,比黑曲霉低。

  2.2淀粉酶对淀粉的酶解产物分析

  对硫酸铵沉淀后的粗酶酶解可溶性淀粉的产物进行薄层层析,结果表明,葡萄糖是惟一可见的酶解产物(图2),此作用方式为典型的葡萄糖淀粉酶的作用方式,因此串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌产生的淀粉分解酶主要为葡萄糖淀粉酶。2.3葡萄糖淀粉酶的最适反应温度

  不同温度下测定2种镰刀菌所产葡萄糖淀粉酶的活性(图3),结果显示此酶在50~60℃范围内酶活性最高,30~50℃有70%以上的活性,温度达到60℃时以上酶活性降低。

  2.4葡萄糖淀粉酶的热稳定性

  串珠镰刀菌产生的葡糖淀粉酶在40℃以下很稳定(图4),40℃保温90min酶活性基本没有损失;50℃保温酶活损失很快,保温90min损失70%以上;60℃条件下酶活迅速丧失,保温10min酶活性已经损失90%以上,表明此酶的热稳定性较差。

  禾谷镰刀菌所产葡萄糖淀粉酶与串珠镰刀菌所产酶的热稳定性基本一致(图5),可能是由于两株菌进化关系较近,所产酶的结构也可能较为类似,因此导致其热稳定性基本一致。

  2.5酶的最适反应pH

  对葡萄糖淀粉酶的最适反应pH研究结果发现(图6),串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌葡萄糖淀粉酶最高酶活出现在pH5.0附近,微酸性环境中酶活性较高,pH小于4.0时酶活性迅速下降。

  2.6葡萄糖淀粉酶的pH稳定性

  研究了2种镰刀菌葡萄糖淀粉酶的pH稳定性(图7),结果表明,2种酶在pH5.0~7.0之间稳定性较好,pH5.0~7.0之间30℃放置6h酶活性保持90%以上,pH4.0以下酶活性丧失较快。

  2.7不同金属离子对2种镰刀菌葡萄糖淀粉酶活性的影响

  研究了不同金属离子对葡萄糖淀粉酶活性的影响(图8),结果发现,Mn2+、Cu2+对2种镰刀菌葡萄糖淀粉酶活性都有较强的激活作用,其中Mn2+激活作用最强烈,Mn2+作用后禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌葡萄糖淀粉酶的活性分别为对照的176%和173%。Na+、Ca2+、Fe2+对酶活性有抑制作用;而K+、Mg2+、Zn2+对酶活性有轻微激活作用。

  3讨论

  有关曲霉属及根霉属菌株葡萄糖淀粉酶及其酶学性质的研究较多[6-10],镰刀菌属的半裸镰刀菌[11]、尖孢镰刀菌[11]、茄腐皮镰刀菌[12]、蔗草镰刀菌[12]、串珠镰刀菌[16,17]等产葡萄糖淀粉酶也有报道,不同来源的酶性质存在很大差异。

  茄腐皮镰刀菌[12]产的葡萄糖淀粉酶在50℃时稳定,50℃保温60min酶活性仍保留79%;Tochukwu等[14]筛选的一株镰刀菌所产葡萄糖淀粉酶在40~70℃之间酶活性都比较高,最高酶活出现在50℃,而且热稳定性非常高,70℃保存30min酶活性仍保留78%;尖孢镰刀菌和蔗草镰刀菌[9]的最适反应温度分别为30℃和40℃。本试验中2种镰刀菌在50℃时有最高酶活性,50~60℃之间酶活性较高;然而热稳定性较差,50℃保温1h酶活力剩余不到50%,其最适反应温度以及热稳定性与报道的曲霉菌及链霉菌属中葡萄糖淀粉酶的性质较为相近[7,8]。

  真菌葡萄糖淀粉酶的最适反应pH多为酸性,而且一般在酸性及中性pH时稳定[8,12,14]。茄腐皮镰刀菌[12]在pH3.0~5.0有较高的酶活性;尖孢镰刀菌和蔗草镰刀菌[18]分泌淀粉酶的最适反应pH为6.9;Tochukwu等[14]筛选的镰刀菌在pH6.5~8.5有较高的酶活性,pH4.5~7.0稳定。而本试验结果表明,禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌在弱酸性条件下酶活性较高,最高酶活性出现在pH5.0~6.0。在本研究pH5.0~7.0条件下酶活性都保留90%以上,pH4.0以下处理酶活性丧失很快。

  大部分淀粉酶的活性都需要有金属离子的参与,特别是二价金属离子对淀粉酶的活性有激活作用。文献报道真菌葡糖淀粉酶一般被Cu2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+等不同程度地激活[9,10,12],但不同金属离子对不同来源的酶的作用有所差异[5]。茄腐皮镰刀菌[12]葡萄糖淀粉酶酶活性被Cu2+、Mg2+激活,被Hg2+、Pb2+、Zn2+、Ni2+以及Fe3+抑制;Tochukwu等[14]筛选的菌株所产酶被Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+等激活,被Mn2+以及Fe2+抑制。本试验中,Mn2+、Cu2+对2种镰刀菌都有较强的激活作用,其中Mn2+激活作用最为强烈,Na+、Ca2+、Fe2+对酶活性有抑制作用。

  可见,不同来源的菌株所产的葡萄糖淀粉酶性质不同,通过对不同菌株的筛选研究发掘不同性质的酶可以应用于不同的行业。本试验对禾谷镰刀菌以及串珠镰刀菌所产生的葡萄糖淀粉酶的部分酶学性质进行了研究,以期对这2种菌葡萄糖淀粉酶的开发利用提供一定的借鉴作用。

  参考文献:

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