[摘要]锌铁调控转运蛋白(ZRT， IRT-like protein， ZIP)在植物生长发育过程中起重要的调控作用。研究采用实时定量PCR(QPCR)和RACE技术，首次从珍稀濒危兰科药用铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到1个ZIP基因cDNA全长，命名为DoZIP1，提交GenBank获得注册号KJ946203。生物信息学分析显示，该基因开放阅读框1 056 bp，编码1条由351个氨基酸组成的肽链，相对分子质量37.57 kDa，等电点6.09。推定的DoZIP1蛋白具有保守的锌铁调控转运相关蛋白结构域，二级结构包含α螺旋50.71%、延伸链11.11%、β转角1.99%与随机卷曲36.18%，具有信号肽和8个跨膜域，预测定位在质膜。该蛋白质氨基酸序列与拟南芥、苜蓿、水稻等物种ZIP蛋白相似性较高，系统进化分析表明其与AtZIP10，OsZIP3蛋白的亲缘关系较近，聚在一个分支。QPCR分析表明，DoZIP1基因转录本在根中相对表达量较高，为茎中的4.19倍;叶次之，为茎的1.12倍。DoZIP1基因的分子特征为下一步研究其在铁皮石斛生长发育过程的生物学功能奠定基础。
[关键词]农业科技论文投稿,铁皮石斛,锌铁调控转运蛋白,基因克隆,序列分析,实时定量PCR
Cloning and expression analysis of a zinc-regulated transporters (ZRT)，
iron-regulated transporter (IRT)-like protein encoding gene in
Dendrobium officinale
ZHANG Gang1，2， LI Yi-min1， LI Biao2， ZHANG Da-wei2， GUO Shun-xing2*
(1. College of Pharmacy and Shaanxi Provincial Key Laboratory for Chinese Medicine Basis & New Drugs
Research， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xi′an 712046， China;
2. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences-Peking Union
Medical College， Beijing 100193， China)
[Abstract]The zinc-regulated transporters (ZRT)， iron-regulated transporter (IRT)-like protein (ZIP) plays an important role in the growth and development of plant. In this study， a full length cDNA of ZIP encoding gene， designed as DoZIP1 (GenBank accession KJ946203)， was identified from Dendrobium officinale using RT-PCR and RACE. Bioinformatics analysis showed that DoZIP1 consisted of a 1 056 bp open reading frame (ORF) encoded a 351-aa protein with a molecular weight of 37.57 kDa and an isoelectric point (pI) of 6.09. The deduced DoZIP1 protein contained the conserved ZIP domain， and its secondary structure was composed of 50.71% alpha helix， 11.11% extended strand， 36.18% random coil， and beta turn 1.99%. DoZIP1 protein exhibited a signal peptide and eight transmembrane domains， presumably locating in cell membrane. The amino acid sequence had high homology with ZIP proteins from Arabidopsis， alfalfa and rice. A phylogenetic tree analysis demonstrated that DoZIP1 was closely related to AtZIP10 and OsZIP3， and they were clustered into one clade. Real time quantitative PCR analysis demonstrated that the transcription level of DoZIP1 in D. officinale roots was the highest (4.19 fold higher than that of stems)， followed by that of leaves (1.12 fold). Molecular characters of DoZIP1 will be useful for further functional determination of the gene involving in the growth and development of D. officinale. [Key words]Dendrobium officinale; zinc-regulated transporters; iron-regulated transporter-like protein (ZIP); gene clone; sequence analysis; real time quantitative PCR
doi：10.4268/cjcmm20150108
锌(Zn)是生物体中普遍存在的一种必需微量元素，对植物体的生长发育至关重要[1]。其作为300多种酶的辅因子不仅参与植物体的各种生理生化代谢途径，而且在维系细胞膜稳定性和调控基因表达方面也起重要作用[1-2]。适当增加体内锌含量可提高植物产量并改良品质，锌缺乏则会导致植物细胞光和生理、蛋白合成以及质膜系统等功能异化，严重影响植物的生长发育[3]。因此，控制锌离子在植物体内的生理平衡，对于维系植物体正常生理代谢是必须的。研究发现，许多膜转运蛋白基因家族都涉及植物中锌的吸收、转运和体内平衡，其中，锌铁调控转运蛋白[zinc-regulated transporters (ZRT)， iron-regulated transporter (IRT)-like protein， ZIP]是介导锌转运的一类重要蛋白[4]。现已从拟南芥[5]、苜蓿[6]、菜豆[7]、玉米[8]、大麦[9]和水稻[10]等植物中鉴定了大量ZIP基因家族成员。绝大多数ZIP蛋白含8个跨膜区及相似的膜拓扑结构，C-和N-末端位于膜外，位于胞内的“可变区”与Zn2+的结合、转运密切相关[4]。除了转运Zn2+，ZIP蛋白还负责胞内Fe2+，Mn2+，Cd2+等2价阳离子的转运，同时，ZIP基因家族成员间表现出对不同离子的特异性和专一性[2，4]。可见，ZIP蛋白在维系植物细胞内部分金属阳离子稳态方面起关键调控作用。
铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium多年生草本植物，药用部位为新鲜或干燥茎，具有益胃生津，滋阴清热，润肺止咳，明目强身等作用，是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种[11]。铁皮石斛主要含多糖、生物碱、氨基酸、菲类化合物和微量元素等有效成分，具有重要的药理活性[12]。铁皮石斛已在生物学、药理学等方面研究取得较大进展，但分子生物学研究相对匮乏[13-14]，限制了对其遗传改良和资源开发。前期利用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术富集菌根真菌侵染铁皮石斛根的差异表达基因[15]，分离到1条352 bp的EST，与水稻OsZIP8(GenBank注册号BAJ25746)一致性较高(75%)，编码一段ZIP蛋白羧基端肽链。鉴于ZIP基因在植物细胞生理代谢中的重要作用，本研究运用RACE技术克隆DoZIP1基因，并进行生物信息学和表达分析，为进一步揭示该基因在铁皮石斛生长发育中的功能奠定基础。
1材料与方法
1.1样品野生铁皮石斛D. officinale植物材料采自云南西双版纳，取石斛根、茎、叶组织样品，液氮速冻后置-80 ℃保存备用。
1.2RNA提取和cDNA合成按照EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab， China)操作说明制备各样品总RNA，NanoDropTM 2000分光光度计(Thermo Fisher， USA)分析RNA质量、纯度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性。按照M-MLV Reverse Transcriptase Kit (Promega， USA)操作说明，逆转录合成cDNA第一链，-20 ℃保存备用。
1.3RACE与RT-PCR验证根据原EST设计2对引物，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clotech， Japan)说明书进行巢式5′-RACE扩增。5′-RACE引物为：R1 5′-ACTATGCAGTAATTTAAGCCCATTTGGC-3′，R2-nest 5′-ATTTAAGCCCATTT GGCTAAAAG-3′(下划线碱基反向互补为终止密码子)。用2 μg总RNA合成5′-RACE ready cDNA，稀释10倍，-20 ℃保存备用。
以R1与UPM组合，使用Program 1程序进行第一轮5′-RACE。反应体系：10× Advantage 2 PCR buffer 2.5 μL，dNTPs (10 mmol・L-1)0.5 μL，R1(10 μmol・L-1)0.5 μL，UPM (10 μmol・L-1) 0.5 μL，5′-RACE ready cDNA 1.0 μL，50 × Advatange 2 Polymerase Mix (5 U・L-1) 0.5 μL，补ddH2O至25 μL。各取1.0 μL反应产物作为模板，以R2-nest与Nested Universal Primer A (NUP)组合，进行第2轮5′-RACE。PCR程序为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32个循环;72 ℃ 7 min，4 ℃保温。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，TianGen胶回收试剂盒(TianGen， China)纯化目的条带，连接至pMD18-T vector (Takara， China)，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，随机挑选3个克隆并送上海生工测序。 1.4生物信息学分析使用一系列网络在线工具进行DoZIP1基因及编码蛋白的生物信息学分析。利用NCBI的BLASTx(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)和ORF Finder(http：//www.ncbi.nlh.nih. gov/gorf/gorf.htmL)分析cDNA序列;用InterProScan(http：//www.ebi.ac.uk/cgi-bin/iprscan/)和PROSITE SCAN(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/-npsa_ automat.pl?page=/NPSA/npsa_proscan.htmL)分析蛋白质结构域和基元;Protparam(http：//web.expasy.org/protparam/)和SOPMA(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin /secpred_sopma.pl)分析蛋白质理化性质和二级结构;ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale)分析蛋白的亲水性/疏水性;SignalP 4.0 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽;TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白跨膜域。PSORT(http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/ form. htmL)进行亚细胞定位分析。用DNASTAR 6.0，MEGA 4.0分别进行DoZIP1蛋白的氨基酸序列比对和进化树构建分析。
1.5实时定量PCR分析分别用2 μg根、茎、叶样品总RNA反转录合成cDNA，EF1a为内参基因[16]，qPCR分析DoZIP1基因的组织表达模式。引物为qPCR-F (5′-CGGGCTTCATCCACATACT CC-3′)和qPCR-R(5′-AACTATTCCCACCTCCAACACC-3′)的扩增产物长347 bp。用ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems， USA)进行扩增。反应体系25 μL包括2× SYBRR Premix Ex TaqTM Master Mix (Takara， China) 12.5 μL，正反向引物(10 μmol・L-1) 0.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9 μL。每个反应重复3次，包括不加模板的对照，实验重复3次。PCR程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40个循环，反应结束绘制溶解曲线。根据ABI PRISM 7500 SDS软件(Applied Biosystems， USA)生成的循环阈值(Cycle threshold， CT)，用2-ΔΔCt法[17]计算相对表达量。
2结果与分析
2.1DoZIP1基因的克隆分析2次巢式5′-RACE扩增获得长度约为1.1 kb的目标条带(图1)。因为R2-nest下游引物跨原EST的终止密码子，该目标产物应该系基因全长。克隆、测序和拼接分析获得了一条1 100 bp的cDNA，BLASTx分析显示其与GenBank已注册的植物ZIP基因一致性为56%～64%。其包含的ORF长1 056 bp，5′-UTR长31 bp，3′-UTR长13 bp，起始密码子附近序列AAAATGA符合KOZAK规则[18]，表明已成功获得基因全长，命名为DoZIP1，提交GenBank获得注册号KJ946203。
1.5′RACE扩增产物; M .DL 2 000相对分子质量标准。
2.2DoZIP1蛋白的理化特性推定的DoZIP1蛋白含Leu最多，为47个(13.4%)，其次是Ala，Gly和Ile，均为33个(9.4%)，其他氨基酸数目在6.0%～0.9%，如Phe为20个(5.7%)，Thr为17个(4.8%)，Trp仅3个，占0.9%。Protparam预测其分子式为C1727H2732N436O468S15，含351个氨基酸，等电点(pI)6.09，相对分子质量37.57 kDa，正电残基(Arg+Lys)21，负电残基(Asp+Glu)27，不稳定系数36.13，脂肪系数高达119.77，亲水性系数0.610。ProtScale分析结果显示，DoZIP1蛋白疏水性最大值为3.456，亲水性最高值为-3.211，且在较多位置上均表现出疏水性，说明其是1个疏水性蛋白质。
2.3DoZIP1蛋白的二级结构、结构域和保守基序分析SOPMA预测结果显示(图2)，DoZIP1蛋白二级结构共有α螺旋(alpha helix， 50.71%)178处，随机卷曲(random coil， 36.18%)127处，延伸链(extended strand， 11.11%)39处以及β转角(beta turn， 1.99%)7处;α螺旋和随机卷曲为二级结构的主要元件，分散于整个蛋白质中。
InterProScan分析表明，DoZIP1蛋白含有锌铁调控转运相关蛋白结构域(42～348)，以及1个典型的保守基序(HSVIIGLSLGA，209～219)。PROSITE SCAN分析表明DoZIP1蛋白含有数目不等的功能基元，包括2个N-糖基化位点(104～107，326～329)、3个蛋白激酶C磷酸化位点(42～44，225～227，287～289)、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(22～25，184～187)、8个N-肉豆蔻酰化位点(87～92，180～185，214～219，241～246，243～248，272～277，276～281，295～300)和1个酰胺化位点(34～37)，这些基元可能对蛋白的结构和功能具有重要的作用。 2.4DoZIP1蛋白亚细胞定位、信号肽和跨膜域预测PSORT预测DoZIP1蛋白定位在质膜的可能性最高为64%，定位于高尔基体几率为46%，定位于内质网膜为37%，内质网腔为10%。SignalP4.1预测分析DoZIP1蛋白含1个信号肽(1～24)，为分泌蛋白。TMHMM分析结果显示(图3)，DoZIP1蛋白具有8个跨膜区(5～22，42～64，76～98，120～142，197～219，261～283，290～311，326～348)，位于第4，5个跨膜域间的可变区处于胞内，说明该基因编码蛋白很可能为膜定位蛋白。
2.5DoZIP1和其他植物ZIP蛋白的多序列对比运用DNAStar 5.0中的MegAlign程序对DoZIP1蛋白和已知植物ZIP蛋白进行多序列对比分析。DoZIP1与葡萄(Vitis vinifera， XP_002264621)、柑橘(Citrus sinensis， XP_006481378)、毛果杨(Populus trichocarpa， XP_002307860)、蓖麻(Ricinus communis， XP_002527722)和水稻(Oryza sativa， Q7XLD4)等植物ZIP蛋白的一致性分别为61.8%，61.5%，61.3%，60.4%，50.1%(图4)。
2.6DoZIP1与拟南芥、水稻ZIP家族蛋白的进化关系下载具有代表性的拟南芥Arabidopsis thaliana和水稻Oryza sativa ZIP家族蛋白氨基酸序列，使用MEGA 4.0 软件邻接法(Neighbour-joining， NJ)构建系统进化树(图5)。结果显示，DoZIP1蛋白与ATIRT1，AtZIP8，OsZIP3，AtZIP10聚成一个分支，与OsZIP3，AtZIP10的亲缘关系较近。
2.7基因表达模式分析分别提取铁皮石斛根、茎、叶等样品总RNA，利用实时定量基因扩增荧光检测系统(QPCR)技术检测基因表达模式。DoZIP1基因在3种组织中为组成型表达，相对表达量有明显差异，转录本在根中相对表达量较高(图6)，为茎中的4.19倍，叶中次之(1.12倍)。
3讨论
锌铁调控转运蛋白通过介导Zn2+，Fe2+，Mn2+，Cd2+等2价阳离子的转运，调节胞内离子稳态，在植物生长发育过程中起重要调控作用。关于植物ZIP基因的系统性研究主要来自拟南芥[5]、苜蓿[6]、菜豆[7]、玉米[8]、大麦[9]和水稻[10]等重要模式植物或者作物，尚未见到药用植物ZIP基因的相关报道。植物ZIP通常呈多基因家族，各成员之间协同作用控制着植物对微量元素的高效吸收和利用。铁皮石斛生于海拔约1 600 m的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的特殊环境，生长缓慢，极难存活，野生资源濒危[13]。鉴定铁皮石斛ZIP家族基因并研究其生物学功能，揭示特殊生长环境下微量元素高效利用的生理机制，将为道地药材形成的分子机制和高产优质品系的培育提供理论依据。因
此，本研究利用RACE技术分离到1个铁皮石斛锌铁调控转运蛋白编码基因DoZIP1，并分析了编码蛋白理化特性、结构域、跨膜域、亚细胞定位以及进化关系等生物信息学特征。
DoZIP1与多种植物ZIP基因一致性较高，编码蛋白有ZIP家族的保守结构域和多个基序，其氨基酸数(351个)介于植物ZIP蛋白氨基酸数309～476[8]，可变区亦富含结合金属离子的组氨酸残基，这些符合植物ZIP的序列特征[4]。DoZIP1蛋白包含信号肽和跨膜域，系膜蛋白，印证了PSORT的质膜定位分析，和其他植物ZIP蛋白的膜定位特性一致[2，4]。同一基因家族的不同成员一般包含相似序列和功能结构域，执行类似的生物学功能[19]。DoZIP1与OsZIP3，AtZIP10处于ZIP系统进化树的同一分支上、亲缘关系较近，OsZIP3受缺锌条件诱导参与水稻对锌的吸收[10]，DoZIP1蛋白应该具有相类似的作用。植物对矿质元素的吸收主要在根中进行，细胞利用离子通道、转运子等蛋白通过质外体或共质体策略介导矿质元素的吸收、转运和分配，调控植物的生理适应和生长发育[6]。实时定量PCR分析结果显示DoZIP1基因在石斛根中表达丰度较高，因此推测该基因可能在石斛根中发挥转运微量元素的生理作用。当然，DoZIP1基因究竟在微量元素转运过程的怎样起作用，石斛ZIP基因家族其他成员与其功能有何差异，是否存在相互作用，这些有待于进一步深入研究。
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