多沙唑嗪对血管狭窄和一氧化氮的影响

　　目的：探讨多沙唑嗪对兔腹主动脉球囊损伤后血管狭窄的影响，及其与血清一氧化氮、血管内膜中膜平滑肌细胞增生的关系。
　　方法：23只新西兰兔随机分为3组，其中正常对照组5只，球囊损伤组9只，多沙唑嗪组9只。正常对照组用普通饲料喂养，不予任何方式处理。另两组行腹主动脉球囊损伤术，同时多沙唑嗪组应用多沙唑嗪控释片4mg/d，术后4周处死兔，观察各组血清一氧化氮差异，以及血管损伤处血管内膜、中膜、外膜厚度、新生内膜面积、管腔面积、内弹力层及外弹力层包围面积、血管内膜中膜增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组化阳性平均灰度的变化情况。
　　结果：球囊损伤成功造成兔血管狭窄模型。手术开始时多沙唑嗪组和球囊损伤组两组血清一氧化氮水平无差异(p＞0.05)，手术4周后多沙唑嗪组血清一氧化氮含量较球囊损伤组增高（p<0.001）。多沙唑嗪组与球囊损伤组血管损伤处相比血管内膜、外膜增生减轻（p<0.05），新生内膜面积减少（p<0.001），管腔面积增加（p<0.001），内弹力层和外弹力层包围面积增加（p<0.001），血管内膜中膜PCNA阳性平均灰度降低（p<0.001）。
　　结论：多沙唑嗪可以抑制球囊损伤后兔腹主动脉血管的狭窄，可以抑制血管内膜中膜平滑肌细胞增殖，可以增加血清一氧化氮含量。这可能有助于减轻或预防PCI术后再狭窄，为临床药物预防PCI术后再狭窄开辟一种新的治疗途径。
　　关键词：狭窄，多沙唑嗪控释片，一氧化氮，血管平滑肌细胞
　　
　　前言
　　PTCA术后6个月高达30－40％的再狭窄率【1】成为其广泛应用和发展的主要障碍。研究表明血管内皮细胞的损伤是再狭窄的启动因素，血管平滑肌细胞增殖是决定再狭窄的关键因素，血管重构参与再狭窄的形成【2】。多沙唑嗪是美国Pfizer公司从1978年最早研究开发的一种长效选择性α1交感神经肾上腺素能受体阻滞剂,被广泛用于治疗高血压和前列腺肥大并取得了良好的效果。研究表明多沙唑嗪可以抑制前列腺平滑肌细胞的增殖和促进平滑肌细胞的凋亡，并且抑制细胞外基质的合成【3】。这一作用是否能出现在心血管系统尚不明确，曾有研究提示多沙唑嗪可能具有降低PTCA后血管再狭窄的作用【4】。本研究试图探讨多沙唑嗪对血管再狭窄的影响及机制。观察其能否减轻血管损伤后狭窄的程度，并试图探索其机制，为以后临床防治再狭窄提供理论依据。
　　材料和方法
　　1材料
　　健康纯种新西兰兔23只，体重2.0-2.5kg，由昆明医学院动物科提供。随机分为3组，正常对照组5只，球囊损伤组9只，多沙唑嗪组9只。三组性别、体重无差异。
　　2方法
　　2.1动物血管球囊损伤后狭窄模型的建立
　　用氯氨酮注射液（25mg/kg）和氯丙嗪注射液（12.5mg/kg）肌肉注射麻醉兔，固定于手术台上。取右股动脉区为手术区，75％酒精消毒，沿股动脉方向作一纵切口，逆行钝性分离并游离股动脉。在股动脉上剪一切口，放置5F动脉鞘，经动脉鞘将3.5×23mm球囊送入20cm至腹主动脉膈下处，用压力泵以8个大气压充盈球囊，回抽球囊，直至有阻力为止，表明球囊已到腹主动脉与髂动脉分叉处，释放球囊内压力，1分钟后，重复送入球囊至20cm标记处，再次扩张，如此反复抽拉3次，每次30秒，间隔1分钟，术后即刻通过耳缘静脉注射肝素钠5000u并注射庆大霉素8万u预防感染。局部缝合包扎。术后继续1％胆固醇高脂饲料喂养4周，多沙唑嗪组给予多沙唑嗪控释片4mg/d灌胃，4周后经耳缘静脉注入50ml空气处死兔。迅速取出腹主动脉，放入4%多聚甲醛中固定，待做病理切片及PCNA分析用。
　　2.2组织形态学观察及计算机图像分析
　　取球囊损伤部位的腹主动脉,每段长4-6mm,置于4%多聚甲醛溶液中固定24小时,不同浓度酒精逐级脱水,石蜡包埋,连续切片5张(片厚5μm),行H-E染色,中性树胶封片,在光学显微镜下观察血管壁厚度、管腔大小及内膜增生情况。利用Hias-1000计算机图像分析系统分别测出血管内膜、中膜、外膜厚度、新生内膜面积、管腔面积、内弹力层和外弹力层包围面积。
　　2.3免疫组化标记增殖细胞
　　组织切片于6ml/l过氧化氢液中孵育30分钟，PBS液洗浴，室温下与单克隆抗体孵育60min。使用兔PC-10单抗标记增殖细胞核抗原(proliferationcellnucleiantigen,PCNA),PBS液洗浴后，室温下与生物素标记的二抗孵育60分钟，DAB染色，苏木精复染。各组免疫组化切片应用Hias-1000图像分析系统对血管内膜中膜阳性反应产物进行半定量检测分析。PCNA阳性表达为细胞核呈棕黄色。每张切片随机选取3个视野，在400倍放大下，测量血管内膜中膜免疫组化染色灰度值，然后取其平均值。灰度值从0到255共分为256个等级，灰度值越大表示免疫组化染色越深，平滑肌细胞增殖越明显。
　　2.4血清一氧化氮检查
　　正常对照组于实验开始时经耳缘静脉抽血5ml，测定血清一氧化氮（NO）作为正常对照，另外两组分别于高脂饲料喂养5天时和实验结束时经耳缘静脉抽血5ml测定NO。血清NO测定采用硝酸还原酶法，应用一氧化氮试剂测定盒。
　　2.5统计学处理
　　使用SPSS11.5统计软件包。计量资料数据用均数±标准差表示，组内比较使用配对t检验，组间比较使用单因素方差分析。以P<0.05为结果有统计学意义。
　　结果
　　1.三组血管形态学变化
　　正常对照组血管内皮细胞正常、内弹力板完整，内膜面积为零。球囊损伤组血管内膜有程度不等的增厚，主要由平滑肌细胞、散在的炎性细胞组成，细胞外基质有大量不定形物质沉积，内弹力板分离断裂，中膜平滑肌增生，管腔明显狭窄。多沙唑嗪组血管内膜稍有增厚，较球囊损伤组明显减轻，平滑肌细胞增生不明显，管腔狭窄不明显。
　　表1.三组血管内膜、中膜、外膜厚度（单位：um）
　　组别 外膜厚度 中膜厚度 内膜厚度
　　正常对照组 210±32 233±24 10±7
　　球囊损伤组 587±33 223±36 920±57
　　多沙唑嗪组 368±58 228±25 30±6
　　如表1所示，球囊损伤组、多沙唑嗪组损伤部位血管内膜、外膜均较正常对照组增厚(P<0.001)，但是多沙唑嗪组其损伤部位血管内膜、外膜厚度均较球囊损伤组减低（P<0.01）。而中膜三组无显著性差异（p>0.05）。
　　表2.三组血管动脉管腔面积、新生内膜面积比较（单位：um2）
　　组别 管腔面积 新生内膜面积
　　正常对照组 3720±40 0
　　球囊损伤组 1370±28 1213±260
　　多沙唑嗪组 3430±15 82±12
　　本研究还观察到多沙唑嗪组、球囊损伤组血管管腔面积减小（与正常对照组相比，p<0.05），新生内膜面积明显增加（与正常对照组相比，p<0.001），但是多沙唑嗪组血管管腔面积较球囊损伤组明显增大（p<0.001），新生内膜面积明显减小（p<0.001）。（见表2）。
　　表3.三组血管动脉内弹力层和外弹力层包围面积（单位：um2）
　　组别 内弹力层包围面积（um2） 外弹力层包围面积（um2）
　　正常对照组 3800±412 4900±159
　　球囊损伤组 2595±232 3866±245
　　多沙唑嗪组 3466±143 4548±231
　　此外虽然多沙唑嗪组和球囊损伤组内弹力层包围面积和外弹力层包围面积减小（与正常对照组相比，p<0.01），但是多沙唑嗪组内弹力层包围面积和外弹
　　力层包围面积均较球囊损伤组有显著性增加（p<0.05）。（见表3）。
　　2三组血清NO结果
　　正常对照组血清NO含量为93.72±7.71umol/l，与试剂盒所提供的兔血清NO含量相符。球囊损伤组术前血清NO含量为94.58±18.0umol/l，多沙唑嗪组术前血清NO为89.94±18.01umol/l，三组间无显著性差异（p>0.05）。球囊损伤组术后4周时血清NO含量为21.63±13.56umol/l，与球囊损伤组术前比较明显降低（p<0.001）。多沙唑嗪组术后4周时血清NO含量为62.57±17.33umol/l，与多沙唑嗪组术前相比明显降低（p<0.001）。但是多沙唑嗪组术后4周时血清NO明显比球囊损伤组术后4周时增加（p<0.05）。
　　3三组PCNA免疫组化阳性结果
　　正常对照组血管内膜中膜PCNA阳性平均灰度为3.4±0.9。球囊损伤组血管内膜中膜可见大量平滑肌细胞增生，PCNA阳性平均灰度为112.8±23.4（与正常对照组比较，p<0.001）。多沙唑嗪组血管内膜中膜PCNA阳性平均灰度9.5±1.3（与正常对照组比较，p<0.05）。多沙唑嗪组血管内膜中膜PCNA阳性平均灰度与球囊损伤组相比明显低（p<0.001）。
　　讨论
　　PTCA术后再狭窄是动脉损伤后血管过度修复反应的表现，不仅涉及血管内膜和中膜，血管外膜在损伤修复过程中也有作用，可能参与再狭窄的形成。再狭窄的血管重塑机制是一个复杂的过程，大致由血管弹性回缩、血栓形成、生物活性因子的释放、VSMC增殖迁移、新生内膜形成、内皮修复、细胞外基质的形成及血管重塑等环节构成。血管重塑是血管壁为适应血管腔内血流动力学环境变化而产生的病理生理现象，包括适应性血管重塑和病理性血管重塑，其机制尚不明确。
　　本研究采取球囊血管内膜剥脱法复制血管再狭窄模型，此种方法造成血管的内膜增生与人类PTCA术后再狭窄的病理过程相似【5】。虽然不能模仿人体冠脉狭窄PTCA术后再狭窄的全部病理生理过程，但着眼于其中最重要的血管平滑肌细胞增殖和血管重塑环节并给予处理，希望从中得到启示。本研究发现应用多沙唑嗪控释片4mg/d治疗4周能明显抑制兔损伤处动脉内膜、外膜的增生，并明显增加血管管腔面积，增加血管内弹力层包围面积和外弹力层包围面积。这表明多沙唑嗪控释片能减轻球囊损伤后的血管狭窄，并对血管重塑产生正性调节作用。与Vashisht等【6】对兔的腹主动脉内膜剥脱术后应用多沙唑嗪治疗后发现内膜增生明显被抑制，而且呈剂量依赖性的研究相一致。
　　VSMC的增殖和迁移是血管内膜增生的关键环节，而抑制VSMC的增殖和迁移，则是阻止血管狭窄性疾病的一个重要方面。PCNA位于细胞核内，且仅在S期出现，S期结束时又消失，所以又称细胞周期蛋白，是S期的特异性标记，被作为SMC增殖的指标。本研究发现，多沙唑嗪组损伤动脉内膜中膜PCNA染色阳性颗粒明显少于球囊损伤组，说明多沙唑嗪明显抑制了损伤动脉处的VSMC增殖。
　　研究表明多沙唑嗪可以通过抑制ａ1肾上腺素能受体而抑制VSMC增殖。此外多沙唑嗪能通过与ａ1受体拮抗无关的机制抑制VSMC多条有丝分裂信号途径。Ulrich等已经证明，多沙唑嗪可以通过增加细胞周期依赖性激酶抑剂P27的表达，抑制Rb的磷酸化，使VSMC的有丝分裂停止在G1期，从而抑制细胞的增殖。KintscherU等【7】也发现多沙唑嗪可抑制人冠脉VSMC从G1期至S期的转换，这种作用与多沙唑嗪阻止Rb的磷酸化有关，进一步研究发现多沙唑嗪能抑制血清引起的P27蛋白降解，使VSMC中P27蛋白始终处于较高水平，即阻止P27下调而增加P27的表达。P27属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族，主要通过抑制G1-S限制点中的各种周期蛋白及周期蛋白依赖性激酶而使细胞停滞于G0/G1期。
　　NO主要由内皮细胞和VSMC分泌，由左旋-精氨酸经一氧化氮合成酶（NOS）的作用而生成。具有舒张血管、抑制VSMC增殖的作用。有关多沙唑嗪对NO影响的研究尚不多见。国外有研究报道【8】多沙唑嗪在降压过程中可以增强肾脏组织切片中的NOS活性，增加NO的产生。国内杨君等【9】研究发现高血压患者的肠系膜动脉VSMC具有分泌NO的功能，服用多沙唑嗪的患者其肠系膜动脉VSMC分泌的NO明显增加。本研究发现球囊损伤血管内膜后血清NO浓度明显降低，应用多沙唑嗪4周可使兔血清NO含量明显上升。结果与国内、外的相关报道相符。NO对再狭窄有防治作用，主要通过抑制VSMC增殖、抑制血小板粘附和聚集、抑制白细胞粘附、影响血管重塑等机制发挥作用【10】。有研究发现NO是通过上调p27和p21,延长细胞周期而抑制VSMC增生的【11】。NO通过使p27和p21的表达上调，抑制Rb蛋白磷酸化，使VSMC停滞在G0期，细胞周期在G1期受阻,SMC增殖受抑。本研究亦发现多沙唑嗪能够增加血清NO含量，并表现为减轻血管狭窄，这是否为多沙唑嗪通过增加血清NO含量，上调p27和p21表达，抑制VSMC增殖，从而达到减轻血管狭窄的结果还有待于进一步研究。
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