[摘要] 目的 研究3′-大豆苷元磺酸钠(3′-DSS)对四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝损伤的影响。 方法 取雄性昆明种小鼠60只，每组12只，随机分为对照组、模型组、联苯双酯阳性对照组、0.1 mg/kg 3′-DSS组和0.3 mg/kg 3′-DSS组。每星期进行2次腹腔注射10%CCl4植物油溶液0.1 ml/10 g，造成慢性肝损伤模型，期间给予灌服2.5 mg/kg联苯双酯、0.1 mg/kg 3′-DSS、0.3 mg/kg 3′-DSS，持续6周，给药结束后，分别取血和肝脏，分离血清，制备肝均浆，检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性和肝药酶含量。 结果 与对照组比较，模型组小鼠肝功能明显下降，ALT、AST水平明显升高，肝药酶含量明显下降;与模型组比较，0.1、0.3 mg/kg 3′-DSS治疗组ALT、AST水平均有明显下降;肝药酶含量也明显增加。 结论 3′-DSS对CCl4所致小鼠肝损伤具有明显的保护作用。
[关键词] 医生评职称论文投稿,3′-大豆苷元磺酸钠,肝损伤,四氯化碳,丙氨酸氨基转移酶,天冬氨酸氨基转移酶,肝药酶
肝脏是人体最大的实质性器官，担负着消化、解毒、分泌和生物合成功能，其功能障碍直接影响人体健康，甚至危及生命。肝病的发病机制较为复杂，涉及炎症反应、免疫功能紊乱、代谢障碍、自由基损害及质膜损伤等多个生理病理过程。对肝损伤的防治目前仍是全球医疗范围内极其重要的一个课题。因此，本研究通过建立实验性肝损伤动物模型、研究肝病的发病机制，筛选保肝药物，探索其作用机制，对于揭示肝损伤的生理病理变化和提高临床治疗水平具有十分重要的意义。
3′-大豆苷元磺酸钠(3′-daidzein sulfonate sodium，3′-DSS)是中药葛根的主要有效成分大豆苷元结构修饰和改性的新合成的水溶性物质，其化学结构式见图1。目前，国内外对3′-DSS对肝损伤的保护作用研究尚未见报道。有研究结果显示，3′-DSS具有耐缺氧、抗氧化、抗心律失常及心肌缺血再灌注损伤再灌注损伤有保护等作用[1-7]。本研究拟通过检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性和肝药酶含量，观察3′-DSS处理后对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝损伤的保护效应。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性昆明(Kunming)小鼠，体重(21±3) g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK(湘)2011-003，合格证号：NO.4304701590。
1.2 实验药品
CCl4(分析纯，江西洪都试剂化工厂生产)，临用前与精制植物油混合配成10%(W/W)CCl4植物油溶液;3′-大豆苷元由沈阳药科大学植化教研室提供，用生理盐水配成所需浓度;联苯双酯滴丸购自北京协和药厂，配成混悬液。
1.3 仪器
BS224S电子天平(德国赛多利斯集团);MIKRO22R低速冷冻离心机(杭州普瑞特仪器有限公司);HS-B6恒温水浴箱(湖北省黄石市医疗器械厂);微量加样器(GILSON公司、Dragon Lab、Eppendorf公司);全自动生化分析仪检测(德国拜耳1605型)，722N可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
1.4 实验方法
按体重将小鼠随机分为5组，每组12只，分别为正常对照组、模型组、阳性药物对照组(2.5 mg/kg联苯双酯)以及0.1、0.3 mg/kg 3′-DSS组，正常组和模型组给予生理盐水(0.1 ml/10 g)，每天按体重灌胃给药，给药剂量为0.1 ml/10 g，此外每周二、六除对照组外均进行腹腔注射10%CCl4植物油溶液0.1 ml/10 g，并记录小鼠体重以及活动情况，持续6周。另一组分组与给药同上，连续给药10 d。末次给药后禁食过夜，24 h后断头处死，放尽血液并迅速剖开腹腔，用冷冻生理盐水冷却冲洗肝脏并取出，称取一定量的肝组织，剪碎，加4倍量冰冷的15%甘油-20 mmoL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)，用玻璃匀浆器匀浆，4℃下用高速冷冻离心机以9000×g离心15 min，得上清液。采用双缩脲法测定上清液蛋白质含量[8]。在比色杯中加入15%甘油-20 mmoL PBS 2 ml和上清液部分0.1 ml，混匀后加入数毫克保险粉并扫描400～500 nm的基线(调零)。然后在比色杯中通入一氧化碳约1 min，静置3 min，再于400～500 nm处扫描样品得到肝药酶的吸收光谱曲线，记录420、450、490 nm处的吸收度，按方法计算肝药酶含量[9]。
1.5 标本采集
给药结束后24 h，取血，室温静置30 min后，12 000×g离心10 min，取血清，-80℃保存，用以检测ALT、AST[10];另一组取肝脏用以检测肝药酶含量。
1.6 检测方法
采用全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST检测;采用分光光度计测定小鼠肝药酶含量。
1.7 统计学处理
采用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况观察
在连续灌胃给药期间，小鼠的皮毛光泽，活动良好，反应敏捷，体重均有所增加。腹腔注射CCl4的植物油溶液后，除空白对照组外小鼠明显活动性减弱，皮毛暗淡，模型组的小鼠出现行动缓慢现象。实验结束前，正常组小鼠活动正常，皮毛色泽、活动情况均良好，模型组小鼠较为萎靡，活动情况显著减弱，阳性药物组、3′-DSS组的皮毛略显粗糙，活动情况一般。 2.2 3′-DSS对CCl4处理小鼠血清ALT、AST的影响
结果显示：腹腔注射CCl4可引起小鼠慢性肝损伤，模型组血清ALT、AST活性明显高于空白对照组(P<0.01)，表示造模成功。3′-DSS各剂量组可显著抑制由CCl4造成的血清ALT、AST活性升高(P<0.05;P<0.01)，结果提示3′-DSS对由CCl4引起的小鼠慢性肝损伤具有一定的保护作用(表1)。
2.3 3′-DSS对小鼠肝药酶含量的影响
模型组小鼠与对照组比较肝药酶含量显著下降，与模型组比较3′-DSS组肝药酶含量显著增加，表明3′-DSS具有诱导药酶的作用(表2)。
3 讨论
近年许多文献指出，肝组织细胞的损伤与自由基毒性反应关系非常密切，CCl4致肝损伤动物模型是研究护肝药最常用的模型。CCl4损伤肝细胞的作用机制主要是CCl4在肝微粒体细胞色素P450代谢生成氧自由基，这些自由基具有很强的生物毒性，攻击肝细胞膜上的磷脂分子，使细胞膜发生脂质过氧化，继而与细胞内蛋白质大分子发生共价结合。细胞膜结构完整性遭到破坏，膜的通透性增加，使胞质内酶类渗入到血液中，同时细胞外水分进入细胞内，使肝细胞发生气球样变等，严重时可导致细胞坏死，使更多的酶类释放进入血液，肝组织中酶含量下降。由于整个肝脏内转氨酶活力比血清内该酶活力高100倍，只要有1%肝细胞膜受损便可使血清酶活力升高1倍。因此，血清转氨酶升高，在一定程度上反映了肝细胞损害和坏死的程度[11-12]。在轻、中度肝损伤时，以ALT升高最为明显，ALT升高远大于AST升高;当严重肝细胞损伤时，线粒体受损，可导致线粒体内的酶被释放入血，此时AST升高更为明显，血清中AST/ALT比值升高。在实验中，CCl4模型肝损伤AST比ALT升高更为显著，肝损伤较为严重[13-15]。本实验的结果显示，3′-DSS低、高剂量组的血清ALT、AST活性明显低于模型组，提示3′-DSS可减轻CCl4所致的肝损伤，其中低剂量组较高剂量组的作用更为显著。
肝药酶即肝细胞微粒体中细胞色素P450系统，是肝脏代谢药物的关键酶[16]，CCl4作为一种肝毒剂可致肝微粒体细胞色素P450含量降低。研究还表明，3′-DSS能明显减轻这种降低作用，提示3′-DSS能在一定程度上诱导肝微粒体细胞色素P450的产生或者可以对抗肝毒剂对肝微粒体细胞色素P450产生损伤的某些环节，从而提高肝脏的代谢能力，促进肝药酶对毒物的清除，起到保护肝脏的作用。
综上所述，3′-DSS对CCl4致小鼠肝损伤有明显的保护作用，能明显降低ALT、AST的水平，明显增加肝药酶含量，其具体的肝保护作用机制，有待进一步研究。
[参考文献]
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