摘要：普通小麦-簇毛麦易位系V8360具有抗逆性强、抗条锈性强和抗白粉性强等许多优良的生物学特性。用9个中国目前流行的条锈菌生理小种对V8360进行了抗条锈性评价，表明该易位系具有良好的抗条锈性。以条锈菌小种CYR32对V8360与感病品种铭贤169配置的F1、F2、F3和BC1代进行苗期抗条锈性遗传分析，并对其中一个F2代群体进行了SSR标记。结果表明，V8360对条锈菌CYR32的抗病性由1对显性核基因控制，暂命名为YrV8360。从329对SSR引物中筛选到位于小麦4AL染色体上的4个SSR位点Xwmc161、Xgwm565、Xgwm494和Xcfd257与该基因连锁。
关键词：作物生成论文,普通小麦-簇毛麦易位系,抗病基因,遗传分析,SSR标记
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.005
Abstract： Stripe rust， caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici， is one of the most widespread and destructive wheat diseases worldwide. Triticum aestivum-Haynaldia villosa translocation line V8360 has strong resistance to abiotic stresses， high resistance to stripe rust and powdery mildew， good biological characteristics. To identify the resistance gene(s) against stripe rust， V8360 was crossed with the susceptible genotype Mingxian 169， F1， F2， F3 and BC1 progenies were analyzed with Chinese race CYR32 at stage of seedling. SSR techniques were used to screen markers linked to the gene conferring resistance to CYR32 in V8360. The results showed that the stripe rust resistance of V8360 was controlled by a single dominant gene， which was temporarily named as YrV8360. Four simple sequence repeat (SSR) markers located on chromosome arm 4AL， Xwmc161， Xgwm565， Xgwm494 and Xcfd257 were linked to YrV8360.
Key words： Triticum aestivum-Haynaldia villosa translocation line; resistance gene; genetic analysis; SSR molecular mapping
由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici)引起的小麦条锈病是世界各主要麦区的重要病害之一[1]。而且小麦条锈病在中国分布范围较广，主要集中在西北、西南、黄淮海等冬麦区以及西北春麦区。迄今，小麦条锈病发生的8次大面积的暴发流行给中国小麦生产带来巨大损失[2，3]。由于抗条锈品种的单一化种植，加速了条锈菌毒性结构的变异，加速了小麦主栽品种抗条锈性的丧失。虽然农药(粉锈宁等)的大面积及时使用可以控制该病害，但要投入大量的人力、物力、财力，而且容易造成污染环境。大量国内外实践表明，种植抗病品种是防治小麦条锈病最有效、经济和环保的措施[4]。因此，引进、鉴定、筛选有效的抗条锈种质资源，挖掘其中的抗病基因，对实现小麦抗条锈基因多样化，培育持久抗条锈病小麦品种十分必要[5]。
随着分子生物学的发展和基因分子作图技术的日益完善，目前已发展了多种以DNA为基础的分子标记技术，如SSR、RGAP、SNP、AFLP等。简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)分子标记被广泛应用于种质资源鉴定、物种进化、基因的分子作图等研究。目前，利用SSR方法已将许多小麦条锈病抗病性基因定位，大部分已正式命名的小麦抗条锈病基因均已获得与其紧密连锁的SSR标记[6]。
因对小麦条锈病、白粉病、全蚀病等病害具有良好抗性，同时分蘖能力强、耐干旱、耐盐碱等优良性状，簇毛麦(Haynaldia villosa，2n=14)近年来已引起众多育种工作者的关注[7，8]。傅杰等[9]通过普通小麦与簇毛麦杂交选育出一系列易位系、代换系和附加系，为利用这一种质资源提供了试验材料。井金学等[10]研究发现，簇毛麦的抗锈基因具有较强的传递性，可转移至普通小麦中。本研究旨在对普通小麦-簇毛麦易位系V8360进行抗条锈性鉴定，明确V8360的抗条锈病遗传规律，挖掘其抗病基因，加快对这一种质资源的利用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
小麦材料为普通小麦-簇毛麦易位系V8360、感病对照为铭贤169、簇毛麦、白粒高38、普通小麦“7182”、V8360与铭贤169杂交后代F1、F2、F3、BC1群体，其中V8360是由簇毛麦与白粒高38、普通小麦“7182”杂交选育而成。小麦条锈菌生理小种(致病类型)为CYR27、CYR28、CYR29、CYR30、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-7、Su11-11。 1.2 苗期抗条锈病遗传分析
将亲本、F1、F2、BC1F1以及F3家系种植于直径为20 cm的花盆中，置于温室按常规方法培养。在供试小麦幼苗生长至二叶期时，用涂抹法接种小麦条锈菌。接种完成后，将小麦幼苗置于黑暗的保湿箱中24 h。之后转入温室内潜育发病，温度为15～17 ℃(昼)/10～12 ℃(夜)，光照周期16 h(昼)/8 h(夜)。反应型调查标准分为11级，即0、0;、0;+、1、1+、2、2+、3-、3、3+、4。0～2+为抗病，3-～4为感病[11]。统计双亲、杂交后代各株系的抗感分离比例，用卡方检验法对期望比例进行检测。
1.3 基因组DNA的提取和抗、感池的构建
基因组DNA提取用CTAB法[12]稍作改进。参考Michelmore等[13]提出的抗病池、感病池建立方法，挑选F2代的10株高抗单株DNA、10株高感单株DNA分别等量混合构成抗病池(BR)和感病池(BS)。构建抗感池的单株均经过F3家系验证其对应F2代单株的纯合性。
1.4 SSR标记筛选和遗传作图
根据R?�ider等[14]和http：//wheat.pw.usda.gov公布的小麦染色体上SSR引物序列信息，由上海Invitrogen生命技术公司合成PCR引物。以V8360、铭贤169、抗病基因池、感病基因池和F2代群体的DNA为模板进行扩增。扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显影。筛选与抗病亲本相关的SSR标记，进而用Map Marker 3.0b软件计算各标记位点与目的基因的遗传距离，最后用Map Draw V2.0软件绘制连锁图[15]。
2 结果与分析
2.1 苗期抗条锈性鉴定结果
V8360和簇毛麦对CYR27、CYR28、CYR29、CYR30、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-7、Su11-11等9个条锈菌生理小种表现良好的抗锈性。感病对照品种铭贤169、白粒高38、“7182”对9个条锈菌均表现高度感病反应(表1)。说明V8360是一个优良的抗条锈病种质资源。
2.2 抗条锈性遗传分析
接种CYR32时，V8360与铭贤169杂交的F1代与抗病亲本一样呈抗病反应，BC1代抗病与感病株数比为10∶9，经卡方检验符合1∶1的分离比;反交组合F2-1中，抗病植株182株，感病植株56株，符合3∶1的分离比例。238株F2单株共收获232个F2∶3家系。对应的F2∶3家系中，纯抗家系63个，抗感分离家系114个，纯感家系55个，分离比例符合1∶2∶1;正交组合F1-2中，抗病植株150株，感病植株48株，符合3∶1的分离比例(表2)。上述结果表明V8360对CYR32的抗病性由1对显性细胞核基因控制，暂命名为YrV8360。以F2-1群体的238个单株构建作图群体，对抗条锈病基因进行SSR标记。
2.3 YrV8360的SSR标记定位
选择分布于小麦21条染色体上的329对SSR引物对抗病材料V8360、感病材料铭贤169、抗病池及感病池进行多态性筛选。结果4AL上的引物Xwmc161、Xgwm565、Xgwm494和Xcfd257在V8360、铭贤169及抗感池间同时扩增出稳定的多态性片段。对F2代群体进行单株扩增，结果大部分抗病单株扩增出与抗病亲本V8360相同的带型(A)或双亲的组合带型(H)，而大部分感病单株则扩增出与铭贤169一致的带型(B)，由此推测这4个位点与YrV8360连锁。
2.4 连锁遗传分析
根据F2分离群体及F2∶3家系反应型，确定F2单株的抗感基因型。由F2所有单株的PCR扩增统计结果可以得出，Xwmc161、Xgwm565、Xgwm494和Xcfd257的扩增位点与YrV8360有明显的连锁关系 (表3)。用Map Maker 3.0b软件进行连锁分析，LOD值设置为3.0，结果显示Xwmc161、Xgwm565、Xgwm494和Xcfd257与抗条锈基因的遗传距离分别为8.6、3.4、4.3和7.5 cM。参照已报道的小麦遗传图谱[16]，根据抗条锈病基因与所获得标记之间的连锁关系可知，YrV8360位于小麦染色体4AL上，且位于Xgwm565和Xgwmb494之间。据此绘制了YrV8360遗传连锁图(图1)。
3 讨论
发掘和鉴定抗条锈病基因是小麦抗病育种的重要工作。开展小麦抗条锈病基因的分子标记研究，一方面通过寻找与抗病基因紧密连锁的分子标记，在基因型水平上对作物种质资源进行深入评价和鉴定。另一方面为通过分子标记辅助选择实现多种基因的累加，培育出多抗或广谱的种质或品种奠定基础。
普通小麦-簇毛麦易位系V8360具有抗条锈病、白粉病等较强抗性以及多种优良农艺性状。本研究发现普通小麦-簇毛麦易位系V8360对中国优势条锈菌小种CYR32具有良好的抗病性，且抗性由1对显性核基因YrV8360控制，被定位在4AL上。
目前，正式命名的62个抗条锈病基因只有Yr51定位在4AL上[17，18]。从染色体位置上分析，Yr51位于染色体长臂末端，而YrV8360位于染色体长臂中间部位，Yr51与YrV8360的距离大约为32.3 cM。从系谱上分析，Yr51的载体品种AUS27858是澳大利亚的农家品种，而YrV8360由中国育种工作者自主选育而成，V8360与AUS27858的系谱并无交集。周新力等[19]研究发现，普通小麦-簇毛麦易位系V9128-1对CYR30的抗条锈病基因YrV1位于小麦染色体3BS上;侯璐等[20]报道，易位系V9128-3对Su11-4的抗条锈病基因YrHV位于染色体2AL;王睿等[21]把易位系V9125-2对CYR29的抗条锈病基因YrWV定位于染色体7DSS上。因此可以初步断定，YrV83660不同于普通小麦-簇毛麦易位系V9128-1、V9128-3和V9125-2中的抗锈基因。综合上述分析，初步判断YrV8360很可能是一个不同于已知抗条锈病基因的新基因。 在目前大量抗源和主栽品种对中国目前流行条锈病生理小种CY32丧失抗病性的形势下，本研究发现的抗病基因YrV8360对抗病育种显得尤为宝贵。V8360综合农艺性状较好，对小麦条锈病又具有良好的抗性，稍加改良就可以用于生产。
参考文献：
[1] LINE R F. Stripe rust of wheat and barley in North America： A retrospective historical review[J]. Annu Rev Phytopathol， 2002， 40：75-118.
[2] WAN A， ZHAO Z， CHEN X， et al. Wheat stripe rust epidemic and virulence of Puccinia striiformis f. sp. tritici in China in 2002[J]. Plant Disease， 2004， 88(8)：896-904.
[3] WELLINGS C R. Global status of stripe rust： A review of historical and current threats[J]. Euphytica， 2011，179(1)：129-141.
[4] 李振岐，曾士迈.中国小麦锈病[M].北京：中国农业出版社，2002.
[5] 吴立人，牛永春.我国小麦条锈病持续控制的策略[J].中国农业科学，2000，33(5)：46-54.
[6] 马东方，王海鸽，唐明双，等.小麦品种中梁21抗条锈病基因遗传分析与SSR标记定位[J].作物学报，2011，37(12)：1-7.
