基因组是生物体遗传信息的携带者和传递者，其中基因是基因组中编码蛋白质的序列，基因的选择性表达对应了生物体生长和发育的不同阶段，揭示了生命活动的内在机理。在农作物育种中，对决定其重要农艺性状的功能基因的研究在遗传改良中具有重要作用，对农作物分子生物学水平的研究具有重大的应用价值。因为转基因作物巨大的经济效益和生态效益，现在国内外的农业生产中都十分重视转基因作物的研究和应用，国内已大量种植转基因的抗虫棉花、大豆等。
摘要：茶是世界上重要的无酒精饮料之一，同时具有很高的保健价值。近年来，在茶树分子生物学的研究领域取得了长足进展，许多功能基因被分离和克隆，对这些基因的研究有助于从分子水平上掌握茶树生物活性物质的代谢调控机制，为茶树品种改良提供新途径。介绍了常用的基因分离技术原理及其在茶学研究中的应用，将有助于从宏观上把握茶树分子生物学研究的现状，为厘清科研思路提供理论依据。
关键词：茶学,基因克隆,表型差异克隆
2009年国家农业部通过了转基因植酸酶玉米和转基因抗虫水稻的生物安全性评价，可用于商业生产。因为茶树是小作物，而且有自交不亲和、生长周期长等特点，所以茶树基因组研究基础比较薄弱。自1994年Takeuchi等[1]报道了第一条茶树基因CHS（查尔酮合成酶）序列以来，取得了较快的发展。如今，NCBIGenBank数据库中已提交的茶树基因编码序列达到197条，其中全长序列占137条；预测的蛋白质序列478条；提交的EST序列达到12664条。但是到目前为止已提交的基因编码序列中有大量的基因功能未知，重要功能基因仅停留在分离和克隆阶段，很多生物活性物质如儿茶素、茶氨酸的代谢途径尚不清楚。因此，对茶树功能基因的克隆和初步研究将在一段时间内继续成为茶树分子生物学研究的主流，把握其研究现状和相关的技术将为以后的科研工作提供理论依据，具有重要的参考价值。
常用的基因克隆方法大致可以分为序列克隆、功能克隆、定位克隆、表型差异克隆和测序克隆5种，下面将分别介绍这几种基因克隆方法的原理及其在茶学研究中的应用。
1序列克隆——根据已知基因部分或全长DNA或RNA序列获得基因
1.1PCR扩增结合RACE技术进行基因克隆
当已知目的基因的序列时（比如通过NCBI网站或者他人的文章得知基因序列），通常采用PCR的方法来克隆基因。其原理和方法是：①如果已知全长序列，对照该序列，设计并合成1对寡核苷酸作引物，提取所要从中分离基因的茶树染色体DNA（如果提取的是RNA，则首先需要在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链），然后通过PCR反应得到目的片段，测序后与已知序列进行比对，因为同一条基因在物种内和物种间均存在多态性，因此所得到的序列不一定与已知序列完全相同。②如果只知道序列片段，可以用上述方法先通过PCR技术得到基因片段，然后结合RACE（Rapid-amplificationofcDNAends，RACE）技术得到全长序列。此方法简便、快速，尤其适于经费不足、分离一些重要基因起步较晚的情况。
β-葡萄糖苷酶与茶叶香气物质的形成有关，王让剑等[2]根据GenBank登录的这两种酶蛋白的氨基酸序列设计引物，从龙井43中克隆得到GlUⅠ（β-葡萄糖苷酶Ⅰ）和GlUⅡ（β-葡萄糖苷酶Ⅱ）基因，在大肠杆菌中表达并纯化出了有活性的蛋白，为其在茶叶加工研究以及在其他食品中的应用奠定了基础。类黄酮化合物是具有抗菌、抗氧化等生物活性的一类次级代谢产物，Lin等[3]根据已知的EST序列片段从茶树中克隆得到全长FLS基因，并用原核表达系统获得了有活性的蛋白。α-tubulin（α微管蛋白）是茶树的看家基因，表达量比较稳定，因此可以作为比较基因和蛋白表达水平时的内参，谭振等[4]根据GenBank登录的α-tubulinmRNA全长序列设计了引物，以RT-PCR方法扩增得到茶树α-tubulin基因全长，将扩增产物用原核表达系统表达了重组蛋白，并制备相应的抗体，以期为茶树功能蛋白的Westernblot提供内参。陈聪等[5]利用GenBank中公布的茶树PCP（花粉壁蛋白基因）序列设计引物以龙井43为材料，采用PCR法扩增并测定了茶树花粉壁蛋白基因内含子序列，并通过序列分析推测该内含子序列可能对PCP基因的表达起到调控作用。PPO基因（多酚氧化酶）对茶叶的品质有重要影响，Liu等[6]根据已知序列，从宜红早茶树中克隆得到PPO基因，首次用原核系统表达出了有活性的PPO蛋白。Wu等[7]从5个不同的茶树栽培种中克隆出了PPO基因，用原核系统表达获得了活性蛋白，并用特殊的载体使其结构发生变化，分析了这种变化对酶活性的影响。Kirita等[8]从一个印度茶树栽培种中克隆了一个新的O-甲基转移酶基因。
1.2根据跨种序列同源性克隆植物基因
生物的种、属之间，基因编码序列的同源性大大高于非编码区的序列。在植物或微生物中的同源基因已被克隆的前提下，可先构建目的物种的cDNA文库或基因文库，然后以已知的同源基因（或者部分序列）为探针来筛选目的文库获得目的基因。1994年Takeuchi等[1]用此方法克隆得到了3个查耳酮合成酶的基因序列CHS1、CHS2和CHS3，这是茶树种最早克隆得到的基因，笔者还分析了光线和各种糖对它们表达水平的影响。同年，Matsumoto等[9]用以水稻PAL（苯基丙氨酸解氨酶）的cDNA为探针，从茶树中克隆得到了PAL基因，同样的方法还用于克隆得到了茶树的β-tubuline基因[10]。ANR（花色素还原酶）是茶树中具有抗氧化作用的活性物质EGCG合成途径中的一个关键酶，郑华坤等[11]根据GenBank已报道的不同植物ANR基因的保守区域设计1对特异引物得到茶树ANR基因片段，进而结合RACE技术从高EGCG茶树品种中克隆得到ANR基因全长序列，并通过原核表达系统得到了预期大小的蛋白。类黄酮化合物是具有抗菌、抗氧化等生物活性的一类次级代谢产物，茶树FS（黄酮合成酶）基因是类黄酮合成途径的关键酶，乔小燕等[12]根据其他物种保守序列设计兼并引物，利用RT-PCR和RACE技术，克隆得到了FSⅡ基因，并分析了其在不同部位的表达水平，对于从分子水平认识、调控茶树类黄酮化合物的生物合成，进行遗传改良具有现实意义。2功能克隆——根据基因表达产物蛋白质克隆基因
对于未知基因序列，但其生理生化及代谢途径比较清楚的蛋白质，通常采用功能克隆的方法获得基因。首先，分离和纯化目的蛋白质或者多肽，并对它们进行氨基酸序列分析，根据氨基酸序列反推出DNA编码序列，然后设计特异性引物，采取PCR的方法克隆出该基因。
1999年Kato等[13]纯化到了TCS（咖啡因合成酶）的蛋白，分析了酶动力学。2000年通过对该蛋白进行测序[14]，利用RACE技术克隆得到了TCS1基因的全长和UTR序列，并在大肠杆菌中表达得到了有活性的蛋白。因为茶树的很多重要的酶，如茶氨酸合成酶蛋白质非常不稳定，难以得到纯的蛋白，所以很难用这种方法得到编码基因序列，目前应用并不多。但是随着蛋白质纯化技术的进步，功能克隆技术将在茶树分子生物学特异性功能基因的克隆中发挥难以替代的作用。
3定位克隆——根据连锁图谱和标签来定位和克隆基因
定位克隆的前提是构建遗传连锁图谱或者有标签的突变体库。构建遗传连锁图谱的方法为：首先利用SSR等分子标记技术进行基因定位，然后以紧密连锁的分子标记为起点，筛选DNAYAC文库，构建目的基因区域的物理图谱，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆到目的基因并通过遗传转化和功能互补试验证实基因功能。操作前提是具有一个根据目的基因的有无而建立起来的遗传分离群体；构建精细的遗传连锁图谱，能够将目的基因定位到染色体的特定位置；还需要构建含有大插入片段的基因组文库作为以连锁的分子标记筛选目的基因用。这种方法在水稻、玉米、小麦、甘蓝等的一些研究中应用广泛。常常用来分离克隆与质量性状如抗病性，数量性状如产量等相关的基因。茶树因为自交不亲和、生长周期长等特点，遗传图谱构建较为困难，还未见通过此方法克隆得到基因的报道。转座子和T-DNA标签技术适用易于遗传转化和基因组全序列已知的物种，在水稻、拟南芥的研究中广泛使用，取得了大量的科研成果，但是在茶树研究中还没有应用。
4表型差异克隆——根据表型差异或组织器官特异表达差异克隆基因
4.1DDRT-PCR
DDRT-PCR技术适用于多个样品间的比较，且操作简便，灵敏度高，应用较为广泛。在动物中QM基因编码核糖体蛋白L10，与癌症的抑制有关。Singh等[15]以茶树干旱、GA和ABA处理过的样品为研究对象，通过DDRT-PCR结合RACE技术克隆到了茶树的QM类似基因，通过对该基因的表达调控分析发现其与旺盛的生长有关，受干旱和ABA的抑制，受GA的诱导。Sharma等[16]以干旱处理、ABA处理和对照3个茶树mRNA文库为材料，用DDRT-PCR技术首次得到了茶树的3个干旱相关EST序列，分析了其对干旱和ABA的应答。王新超等[17]对安吉白茶正常和白化叶片进行差异基因的筛选，得到5个已知的和7个未知的基因片段，对这些基因的研究将有助于了解安吉白茶叶片白化的分子机理。韦朝领等[18]利用DDRT-PCR技术初步研究了茶树被害虫茶尺蠖取食后基因表达谱差异，得到222条差异片段，并对其中20条进行了分类，为揭示茶树的茶尺蠖防御机制提供了试验依据。
4.2cDNA-AFLP
cDNA-AFLP技术具有重复性好、假阳性低等优点，是迄今为止茶树表型差异克隆中应用最多的一种技术。Fang等[19]在研究花发育相关基因过程中克隆得到Tua1基因，该基因与α-tubulin基因同源，用原核系统表达出了蛋白，发现该蛋白可以促进花粉管的生长，有证据表明该基因可能与雄性不育相关。余梅等[20]以大叶乌龙发育早期和晚期的花蕾为材料，用cDNA-AFLP技术分析了差异表达的基因，克隆得到了CsPSP1（花粉特异表达基因），与烟草PSP1基因同源性高达81%，分析其内含子和序列特征，并推测该基因可能在花粉的萌发和花粉管的伸长中起作用。在拟南芥中的研究表明14-3-3蛋白是一个调节蛋白，能与许多功能不同的信号蛋白结合，其在信号转导、细胞周期调控等过程有重要作用，是细胞内信息传递的重要信号分子，余梅等[21]研究发现茶树中也存在14-3-3蛋白，且仅在花发育晚期表达。作为喜热植物，抗寒性对江北茶树种植十分重要，陈暄等[22]利用cDNA-AFLP技术进行了茶树低温胁迫处理的基因表达差异分析，获得低温诱导后特异表达的差异片段，经BLAST比对发现该片段与白菜、拟南芥、烟草的抗寒基因CBF（C-repeatbindingfactor）分别有94%、84%、81%的同源性，而后通过RACE技术获得该片段cDNA全长序列。房婉萍等[23]用同样的方法得到了另一个冷诱导基因CBF和H1-histone1。陈暄等[24]分析了结实率差异显著的龙井43和大叶乌龙2个茶树品种在花蕾发育过程中基因表达的差异。从获得的差异图谱中，克隆得到一个与茶树花发育相关的钙依赖蛋白激酶基因片段，然后用RCAE方法扩增获得其cDNA全长序列，命名为茶树TCK基因。陈林波等[25]利用cDNA-AFLP技术结合RACE技术获得了茶树低温诱导的一个转录因子RAV基因，与多种植物RAV蛋白具有高度同源性。通过对基因表达模式的分析推测该基因在组织中的表达受到严格控制，而且在响应非生物胁迫中发挥重要作用。
4.3SSH
作为表型差异克隆技术的一种，SSH技术较为先进，具有假阳性低、敏感性高、特异性强、操作简便等优点。在烟草、水稻、柑橘、油菜等抗性基因的分离中应用较多。在茶树中尚未见报道。
5测序克隆——通过测定DNA序列克隆基因
5.1EST测序
表达序列标签EST（Expressedsequencetag）是源于mRNA（cDNA）短的、单向测定的序列片段[30，31]，也是一种发现新基因和研究基因表达谱的有效工具。近年来，构建cDNA文库并进行大规模测序已成为一种高效率、低成本的发现新基因的技术，在茶学研究中应用广泛。Chen等[32]构建了龙井43和安吉白茶2个茶树品种新梢的cDNA文库，在大量测定龙井43cDNA文库EST序列的基础上，获得了CHI（查尔酮异构酶）和FS（黄酮醇合成酶）等基因。在已有EST文库的基础上，张亚丽等[33]克隆得到了ACC氧化酶全长基因并进行了表达谱分析，推测可能与抗寒性状有关。紫阳1号是一个常年不开花不结果的特异茶树种质，李冬花等[34]以紫阳1号新梢为材料，构建cDNA文库，进行了EST测序，获得了大量已知功能基因、46个未知功能基因和26个未找到同源序列的基因。这些成果将为茶树花发育相关研究提供理论依据。因为基因表达具有组织和器官特异性，史成颖等[35]以茶树嫩根为材料构建cDNA文库，进行了EST测序，初步确定已知功能基因734个，推定功能基因102个，未知功能基因178个。这些结果既为进一步分离克隆茶树根部功能基因奠定了基础，又为以后差异杂交获取茶树根部特定代谢途径的酶基因及相关的调控基因提供了平台。5.2全基因组测序
一个生物的全基因组序列蕴藏着这一生物的起源、进化、发育、生理及所有与遗传性状有关的重要信息。对农作物进行全基因组测序将大大加快其分子生物学研究进程，加快良种培育的速度。迄今为止，拟南芥、水稻、玉米、高粱、大豆、野草莓等农作物的全基因组测序已经完成。棉花全基因组测序已经启动。茶树的全基因组测序也在进行中。
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